不同频率的周期性压力对兔软骨细胞影响的生物学研究*

黄 正，杨松滨，刘益杰，褚立希，冯 伟，陈世宣

(上海中医药大学康复医学院，上海 201203)

骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是中老年人的一种常见疾病，慢性起病，造成患者关节疼痛、畸形和功能障碍。已经有研究发现，通过一定大小和频率的力学刺激来治疗骨关节炎，具有明显缓解症状和改善关节功能的作用［1］。但是力学治疗采用多大的力度和频率，至今尚无定论，而且治疗OA的机制也尚未明确。关节软骨的退变是OA发生和发展的重要机制。越来越多的研究表明，软骨细胞作为关节软骨的主要组成部分，其凋亡与OA的进程关系密切［2］。在OA患者的关节软骨中，力学信号可以通过多种途径调控软骨细胞的增殖和分化能力。本研究团队的前期工作中已经证实，短期内持续的压力能刺激软骨细胞增殖，172kPa的持续压力下，软骨细胞的增殖能力最强［3-6］。但是力学治疗不仅讲究加压力度，施压的频率对治疗效果也有影响。因此在持续性压力的基础上进一步研究不同频率的周期性压力，对揭示力学方法治疗OA的机理研究具有重要意义。本研究将持续施加的压力改进为施加不同频率的周期性压力，观察不同频率组的软骨细胞增殖和整合素α1β1分泌的差异，进一步揭示手法治疗骨关节炎的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器：胎牛血清(GIBCO，美国)，培养液(Hyclone，美国)，Hank＇s液(Solarbio，中国)，双抗(GIBCO，美国)，0.25%胰蛋白酶(Hyclone，美国)，Ⅱ型胶原酶(Sigma，美国)，CO2培养箱(Thermo，型号：311，美国)，超净台(再鑫仪器，VCM-620，中国)，低温高速台式离心机(Eppendorf，美国)，荧光倒置相差显微镜(OLYMPUS，型号：CKX43，日本)，全自动酶标仪(Bio-Tek，型号：ELX900，美国)。

1.2 施加不同频率的周期性压力控制装置：通过前期研究使用的装置［6］，将压力定为172kPa，加压频率按照分组要求设置B1 组0.2Hz，B 两组0.5Hz，B3 组1Hz，B4 组2Hz和 B5 组5Hz。

1.3 兔关节软骨细胞的分离培养与传代：①取出生时间不到12h的新生新西兰兔2只，处死;②置于75%酒精100mL浸泡15min消毒;③放置在消毒容器里，于超净台中进行软骨分离：剪刀剥离新生兔四肢长骨，剔除干净肌肉、肌腱和筋膜等软组织，用手术刀分离四肢骨骺端透明软骨，并尽量切碎成小于1m3碎屑;④软骨细胞消化分离：将切碎软骨组织放入两个无菌离心管，每管软骨体积约为1mL，加入4mL(4倍于软骨体积)0.25%胰蛋白酶，在37℃水浴锅中消化约40min，加入4mL培养液(与胰蛋白酶等体积)终止消化，放入低温高速台式离心机配平后设定1500转/min，离心5min，吸除上清液;加入4mL浓度为0.5mg/mLⅡ型胶原酶进一步消化，37℃水浴锅中消化4h后，将液体通过200目筛网过滤，滤下的液体放入离心管再经低温高速台式离心机1500转/min，离心5min，吸弃上清液，加入培养液重悬细胞，分别接种于4个培养皿，培养皿加入含10%胎牛血清的培养液，放入37℃、5%二氧化碳及饱和湿度的培养箱中培养。第2天原代软骨细胞贴壁即可换培养液，并于荧光倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。可见原代软骨细胞呈小圆、多角等形态，胞浆淡、饱满，见图1。

每天将培养皿在超净台中更换培养液一次，注意无菌操作，避免细胞污染。一般于24-48h后，显微镜下观察软骨细胞贴壁情况良好，细胞呈梭形。等长满培养皿底部80-90%左右，即可进行消化传代。传代使用1：3的比例，传至第三代细胞表型稳定，即可进行实验见图2。

图1 原代软骨细胞：细胞刚贴壁，生长稀疏，形态呈小圆形、多角形，胞浆淡、饱满。

图2 第三代软骨细胞：细胞生长旺盛、紧密，形态呈梭形、长条形。

1.4 各组软骨细胞增殖的测定：第三代兔软骨细胞生长状态良好、表型稳定，用0.25%胰酶消化分离后离心机1500转/min，离心5min，培养液重悬细胞，调整细胞悬液密度，按3×105个/孔密度接种到6孔板，并分为：A组常规培养不施加压力，B组172kPa压力以不同频率干预2h/d：B1组频率0.2Hz，B2组0.5Hz，B3 组1Hz，B4 组 2Hz，B5 组 5Hz)。干预 3d 后各组按 5×104密度分别接种到96孔板，每组8孔，细胞过夜贴壁。第2天测定细胞增殖：吸弃96孔板培养上液，每孔加入100μL含10%WST-1试剂的培养液，37℃孵育2h后，450nm波长测定各孔吸光度OD值。根据各孔的吸光度和对照孔的比值分析软骨细胞的增殖情况。

1.5 各组软骨细胞培养上清液中整合素α1β1的测定：软骨细胞培养及传代同1.4，细胞消化分离后按3×105个/孔密度接种到6孔板，分组与干预方法同1.4。3d后收集各孔细胞上清液，放入离心管，离心机按照1500转/min，离心20min，仔细收集上液，采用酶联免疫吸附法(ELISA法)测定各组培养上清液中整合素α1β1的含量。

2 结果

2.1 不同频率的周期性压力对兔软骨细胞增殖的影响：相同大小(172kPa)不同频率的周期性压力干预软骨细胞2h/d，作用3d后，细胞 OD 值对照组 A 组为1.08±0.13，B1组为1.19±0.11，B2 组为1.23 ±0.08，B3 组为1.35 ±0.06，B4 组为1.45 ±0.09，B5组为1.37±0.12。加压各组与对照组比较 OD值升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。B组各组间OD值差异也有统计学意义(P＜0.05)，峰值出现在B4组。见表1。

表1 不同频率的周期性压力对兔软骨细胞增殖及整合素α1β1分泌的影响

2.2 不同频率的周期性压力对兔软骨细胞分泌整合素α1β1的影响：相同大小(172kPa)不同频率的周期性压力干预软骨细胞2h/d，作用3d后，整合素α1β1水平对照组A组为3.02±0.26pg/mL，B1组为 3.28 ±0.19pg/mL，B2 组为 3.43 ±0.11pg/mL，B3 组为3.77 ±0.24pg/mL，B4 组为 4.01 ±0.09pg/mL，B5组为3.94±0.13pg/mL，周期性加压各组与对照组比较整合素α1β1值升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。B组各组间差异也有统计学意义，峰值出现在B4组。见表1。

相同大小(172kPa)不同频率的周期性压力刺激兔软骨细胞，均能增加软骨细胞的增殖作用和整合素的含量。其中以2Hz的频率作用最强。

3 讨论

OA是一种慢性、进展性骨关节疾病，发病率很高，给患者和社会带来重大负担。目前已得到共识的观点是，关节软骨的退变是导致OA发生发展的重要机制［7］。关节软骨主要由软骨细胞和细胞外基质构成。胶原纤维是构成细胞外基质的主要结构，能形成复杂的网格状结构，将软骨细胞包裹在内，使关节软骨能承受压力、张力及剪切力。软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞类型［8］，这些力学刺激通过胶原纤维传导至软骨细胞，引起细胞增殖、分化和凋亡等生理变化，最终调节软骨的退变。

整合素是软骨细胞的一种胶原受体，由α和β两个亚单位组成，能够接受来自细胞外基质传导到细胞的力学刺激信号。整合素在力学刺激下与相应的细胞外基质胶原蛋白结合后发生空间结构改变，介导了软骨细胞与细胞外基质之间的信号通路，它是软骨细胞力学信号转导的前提，并进一步调控软骨的增殖、分化、生长、凋亡甚至影响到细胞外基质的结构［9，10］。有研究发现［11］，整合素作为最重要的细胞表面力学刺激受体之一，通过细胞外基质-整合素-细胞骨架信号传导通路，完成力学刺激的传导，在防止细胞凋亡、调节细胞基因表达，甚至在肿瘤的侵袭和转移等生理和病理方面均起着重要的作用［12，13］。已知软骨细胞表达的整合素有：整合素 α1β1、α2β1、α3β1、α5β1、α6β1、α10β1、αVβ3、αVβ5 等，正常成人软骨细胞以 β1型整合素表达为主［11］，特别是 α1β1、α3β1 和 α5β1，因此 α1β1具有很高的研究价值。

力学方法治疗骨关节炎的作用机制离不开生物力学和软骨细胞研究。软骨细胞对骨关节炎的产生和发展起着关键作用。软骨细胞的增殖分化与力学刺激有密切关系，整合素就是揭示这种关系的关键因子，因此研究力学方法对骨关节炎的作用机制，可以从力学刺激-整合素-软骨细胞-骨关节炎这条途径着手。

在前期研究中已经发现，适当的静水压力刺激软骨细胞，能上调Ⅱ型胶原、蛋白多糖和糖氨聚糖等mRNA的表达;并且在一定水平内静水压越高，软骨细胞表型越稳定［3，4］。周期性力学刺激能促进基质合成，而持续性静压力则使基质合成减少［14］。Kian［15］对体外培养的软骨细胞施加24h周期性的牵张力，发现Ⅱ型胶原表达上调，同时作为其受体的整合素α1与之同步上调，而整合素α5则只有较小的变化。马军利等［16］研究发现一定大小和适宜时间的静压力能促进整合素α2的表达，持续时间较长、较大的静压力则抑制软骨整合素α2的表达。这些研究涉及到力学刺激的大小和作用时间等参数，但是没有深入研究力学刺激频率对软骨细胞代谢和基因表达的影响。

研究力学方法对骨关节炎治疗的机制，必须同时阐明力学大小和刺激频率对软骨细胞的影响机制，二者缺一不可。本研究在前期持续性压力对软骨细胞作用的实验基础上，采用同样加压力度、不同频率的周期性压力刺激软骨细胞，研究不同的刺激频率对软骨细胞增殖以及整合素表达的影响。结果显示：施加 172kPa，刺激频率分别 0.2Hz、0.5Hz、1Hz、2Hz、5Hz 的周期性压力，均能增加软骨细胞的增殖作用和整合素α1β1的含量。其中频率为2Hz的周期性压力作用最强。说明力学刺激能够通过上调整合素α1β1，引起基质成分的变化，进一步可以上调软骨细胞的增殖作用。但并非频率越高作用越强。本实验中以2Hz频率的周期性压力作用最强。这对揭示不同频率的力学方法对骨关节炎治疗效果的机制具有重要意义，并且在临床治疗骨关节炎时，对采取何种推拿手法，使用多大的力度和频率进行力学方法治疗具有指导意义。但是哪种频率和多大的力度组合能得到最佳治疗效果，还有这种组合的力学刺激在力学信号通路方面的研究尚未阐明，这将成为今后研究的重点和趋势。

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