消痹方对兔膝骨性关节炎软骨下骨Cyclin D1 mRNA的影响

林乔龄李 民* 陈 志

（1 福建中医药大学附属漳州市中医院，福建 漳州 363000；2 福建中医药大学附属康复医院，福建 福州 350003）

消痹方对兔膝骨性关节炎软骨下骨Cyclin D1 mRNA的影响

林乔龄1李 民2* 陈 志1

（1 福建中医药大学附属漳州市中医院，福建 漳州 363000；2 福建中医药大学附属康复医院，福建 福州 350003）

目的探讨消痹方对兔膝骨性关节炎软骨下骨Cyclin D1 mRNA的影响。方法将新西兰大白兔分为试验组和对照组，术后1周开始分组灌胃治疗。采用X线摄片、光镜对软骨下骨进行组织形态学观察，RT-PCR法检测软骨下骨Cyclin D1的表达。结果试验组软骨下骨退变表现、骨质增生和软骨下骨结构紊乱现象明显较对照组轻，试验组骨转换指标Cyclin D1 mRNA表达量较低（P＜0.05）。结论消痹方通过下调Cyclin D1 mRNA的表达，降低软骨下骨重塑速率。

消痹方；骨性关节炎；Cyclin D1 mRNA

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药物：消痹方由巴戟天、紫河车、杭白芍、青风藤、两面针、白术组成，系根据福建省名老中医章宝春临症经验整理，现为漳州市中医院协定方。

1.1.2 动物：健康6个月龄新西兰大白兔64只，体质量（2000±100）g，雌雄各半。

1.1.3 主要试剂：反转录试剂盒、TRIZOL；PCR引物；CycleTESTTM Plus DNA Reagent Kit；FITC-conjugated Cyclin D1 Antibody Reagent set。

1.1.4 主要仪器：全自动石蜡切片机，万能研究显微镜，紫外分光光度计，超纯水装置，CR系统，基因扩增仪，蛋白核酸分析仪，离心机，低温冰箱，摊片烤片机，生物组织自动脱水机，，生物组织包埋机，电热恒温鼓风干燥箱，紫外透射分析仪，凝胶成像系统，三恒多用电泳仪。

1.2 方法

1.2.1 试验前动物处理：①分组及造模：健康6个月龄新西兰大白兔64只，随机分为试验组和对照组，每组各32只。两组均行常规术前准备，根据改良Hulth法造模[1]：取兔膝关节内侧入路，切断内侧副韧带，摘除内侧半月板，切断前交叉韧带。术后连续3 d肌内注射青霉素20万单位，每日2次。②动物喂养：采用一笼一兔喂养，饲养期间观察其毛色、食欲、活动和体质量变化，术后1周开始每天驱赶2次，每次30 min。③给药：按体表面积换算与人的给药剂量[2]：新西兰兔（2.0 kg）=成人（60 kg）每日药量×0.07×2/3×2.0=1.12 g。试验组给予消痹方水溶液10 mL/d（含消痹方1.12g）灌胃，每日1次；对照组给予生理盐水10 mL/d灌胃，每日1次。④取材：两组动物均于术后1、6、9、12周分批处死取材，每批每组各随机抽取8只动物。

1.2.2 观察指标及检测方法

1.2.2.1 X线片：摄兔双膝正侧位CR片，观察两侧膝关节骨结构，包括周围软组织、关节间隙、关节面的变化及有无骨赘形成。

1.2.2.2 光镜制样与观察步骤：①取材：胫骨内侧髁中央的软骨连同软骨下骨，修成1 cm×1 cm×1 cm大小组织块。②固定：10%福尔马林溶液固定7 d。③冲洗：流水冲洗24 h。④脱钙：10%EDTA二钠盐，溶于0.1 mol/L磷酸缓冲液，以氢氧化钠调至pH 7.0，脱钙14 d。⑤冲洗：流水冲洗24 h。⑥脱水：70%酒精2 h→85%酒精2 h→90%酒精2 h→95%酒精2 h→100%酒精2 h。⑦透明：二甲苯浸泡30 min。⑧浸蜡、包埋：室温25 ℃，石蜡58 ℃，浸蜡4 h中间换2次，常规石蜡包埋。⑨切片、染色：轮转式切片机切5～6 μm的薄片→二甲苯15 min→二甲苯25 min→100%酒精3 min→95%酒精3 min→90%酒精3 min→85%酒精3 min→70%酒精3 min→蒸馏水浸洗2 min→苏木素5 min→自来水洗去浮色→1%盐酸酒精分色→自来水反蓝20 min→70%酒精3 min→85%酒精3 min→二甲苯15 min→二甲苯23 min→中性树胶封片。⑩光镜下观察：关节软骨各层细胞的形态结构和数量变化、是否有群集，软骨有无裂隙，细胞有无凋亡，软骨下有无假性囊肿形成、骨质增生、骨小梁骨折及软骨下骨密度。

1.2.2.3 RT-PCR法检测软骨下骨相关指标：①总核糖核酸（RNA）的提取：总RNA的提取严格依照TRIzol试剂操作说明进行。取适量RNAlaterTM试剂保存的兔骨或软骨组织，置入匀浆器中充分研磨，加入1 mL TRIzol再混合均匀并转移至1.5 mL Ep管中，室温静置5 min；每管加氯仿200 μL，激烈混匀后静置分层，在4 ℃ 12000 rpm的条件下离心15 min，转移上清至一新1.5 mL Ep管；加500 μL异丙醇室温沉淀10 min，在4 ℃ 12000 rpm的条件下离心10 min；用75%乙醇（DEPC水配制）洗沉淀1次，然后风干，溶于适量无RNA酶水中；每一RNA样品取适量紫外分光光度计定量，其余-80 ℃保存待用。②反转录反应：吸光光度仪测定RNA的吸光度值（OD值），用于检测RNA纯度及其浓度。取80 μL DEPC水调零吸光光度仪，取1 μL待测RNA用DEPC水100倍稀释，吸取80 μL稀释后的RNA，测定260 nm和280 nm的OD值。当260 nm OD值与280 nm OD值的比值在1.8～2.0，说明提取的RNA纯度高。RNA的浓度=260 nm OD值×40 μg/mL×稀释倍数，计算出RNA的浓度。20 μL体系反转录过程：RNA 1 μg（根据浓度计算出体积），加0.05 μg/μL Oligo（dT）18 primer 1 μL，再加DEPC水至12 μL，混匀，70 ℃的条件下离心5 min，立即冰水浴，离心。在冰上依次加入5×reaction buffer 4 μL、RibolockTM Ribonuclease Inhibitor 1 μL、10mM dNTP mix 2 μL，混匀，37 ℃条件下离心5 min之后加入RevertaidTM M-MuLV Reverse Transcriptase 1 μL。在42 ℃的条件下静置60 min，再在72 ℃的条件下静置10 min（破坏MLV），最后在4 ℃冰水浴的状态下保存备用。③c-fos扩增引物合成：c-fos引物：产物长度241bp；上游：5'-CGATTCGCCTACTTCC-3'；下游：5'-TCCGCTCCACTTCATT-3'。引物使用前用DEPC水溶解成10 pmol/μL浓度的引物溶液。PCR反应（20 μL体系）：Taq Buffer 10（1.5 μL），dNTP（10 mM，0.2 μL），上游引物（10 pmol/μL，0.3 μL），下游引物（10 pmol/μL，0.3 μL），cDNA模板（1 μL），Taq酶（5 U/μL，0.2 μL），DEPC水（16.5 μL）→混匀，离心→95 ℃ 5 min，预变性→94 ℃ 30sec变性，80 ℃40sec退火，72 ℃30sec延伸，35循环→72 ℃ 7 min，终末延伸→4 ℃保温。

PCR产物加入溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，电流10 mA，电压100 V，电泳时间60 min，电泳结果通过凝胶图像分析系统对条带进行PCR定量；样本c-fos mRNA等产物的PCR定量与内参β-actin的PCR定量比值，为该样本mRNA在组织中的相对含量。

1.3 统计学处理：运用SPSS 18.0软件包处理分析，参数值用均值±标准差表示，组间数据比较采用ONE-WAY ANOVA（单向方差分析）。

2 结 果

2.1 组织形态学观察

2.1.1 造模12周X线片观察结果。试验组：内侧间隙狭窄不明显，关节面粗糙变形，关节边缘有轻微骨赘形成，软骨下骨密度稍增高（图1、2）。对照组：内侧间隙变窄，关节面粗糙变形，关节边缘有明显骨赘，胫骨内侧关节面外侧稍塌陷，软骨下骨骨密度不均匀，硬化与疏松并见（图3、4）。

图2 试验组：侧位片

图3 对照组：正位片

图4 对照组：侧位片

图5 试验组：术后6周骨小梁（HE×100）

图6 试验组：术后9周骨小梁（HE×100）

图7 试验组：术后12周骨小梁（HE×100）

图8 对照组：术后6周骨小梁（HE×100）

图9 对照组：术后9周骨小梁（HE×100）

图10 对照组：术后12周骨小梁（HE×100）

2.1.2 软骨下骨光镜观察结果。试验组：造模后6周软骨下轻度骨骨质疏松，偶见骨小梁骨折（图5）；造模后9周，软骨下骨骨质疏松与骨修复并见，骨结构轻度紊乱，偶见横向骨小梁（图6）；造模后12周，软骨下骨出现局部骨质轻度硬化，骨结构稍紊乱，少量骨赘形成（图7）。对照组：造模后6周软骨下骨骨质疏松严重，可见较多骨小梁骨折（图8）；造模后9周，软骨下骨骨质疏松与骨修复并见，骨结构紊乱明显，可见大量横向骨小梁（图9）；造模后12周，软骨下骨骨质局部硬化明显，骨结构紊乱加重，骨赘形成多（图10）。

2.2 软骨下骨Cyclin D1 mRNA的表达：RT-PCR检测Cyclin D1 mRNA表达结果显示见图11、表1。

表1 Cyclin D1 mRNA电泳条带灰度值比较（INT/mm2）

图11 Cyclin D1 mRNA电泳图

2.2.1 各组组内不同时期比较：对照组造模后1、6、9周，随着时间的推移Cyclin D1 mRNA表达不断增强，它们之间均有显著性差异（P＜0.05）；9周和12周时比较，Cyclin D1 mRNA表达无显著性差异。试验组6、9、12周时相较1周时表达增高，均有显著性差异（P＜0.05）。2.2.2 各组组间比较：试验组造模后6、9和12周Cyclin D1 mRNA表达相较对照组较低，组间有显著性差异（P＜0.05）。

3 讨 论

软骨下骨重塑就是在破骨细胞和成骨细胞的作用下，经历旧骨不断被吸收，新骨又不断形成的过程。骨细胞的增殖速率越高，则软骨下骨重塑越快，Cyclin D1是反应软骨下骨重塑速率的重要指标。消痹方干预后软骨下骨Cyclin D1 mRNA的表达量较低，显著低于对照组，表明消痹方通过下调Cyclin D1 mRNA的表达以抑制软骨下骨的重塑速率，并能有效降低软骨下骨的高转化率，在早期减少软骨下骨骨吸收，中后期抑制软骨下骨骨形成，从而减轻关节软骨退变，延缓骨性关节炎的病理进程。

[1] 刘献祥,李西海,周江涛.改良Hulth造模法复制膝骨性关节炎的实验研究.[J].中国中西医结合杂志,2005,25(12):1104-1108.

[2] 苗明三.实验动物和动物实验技术[M].北京:中国中医药出版社, 1997:143.

R684.3

B

1671-8194（2014）34-0059-03

福建省自然科学基金资助项目（编号2012J01433）；国家临床重点专科建设项目资助；国家中医药管理局“十二五”重点专科建设项目资助

*通讯作者