高速逆流色谱分离制备龙胆中龙胆苷

何长英

湖南省郴州市第三人民医院药剂科 湖南郴州 423000

高速逆流色谱分离制备龙胆中龙胆苷

何长英

湖南省郴州市第三人民医院药剂科 湖南郴州 423000

目的:龙胆中龙胆苦苷的分离制备和含量测定。方法:采用HPLC测定龙胆中龙胆苦苷的含量和HSCCC分离制备龙胆苦苷;HPLC条件:以甲醇、0.1%磷酸溶液(甲醇:0.1%磷酸溶液=24:76)为流动相;流速1mL/min;检测波长270nm;进样量10μL，柱温25oC。结果:经测定，龙胆草中龙胆苦苷的含量为0.5411%。选出正丁醇－水(1:1)为最佳溶剂体系，固定相保留率36.0%，分配系数0.714，上相作固定相，下相作流动相，转速为850r/min，主机正转，流速2mL/min，分离制备出的龙胆苦苷经HPLC检测，纯度可达98%以上。结论:HSCCC仪器性能可靠、分析成本低、易于操作，可分离制备出高纯度的龙胆苦苷。

高速逆流色谱;高效液相;龙胆苦苷;分离制备

龙胆为常用中药，中医取其苦寒之性，泻肝胆实火，除下焦湿热。在临床上，龙胆是龙胆泻肝汤、泻青丸、当归龙荟丸等方剂的主药，具泻肝胆实火、清下焦湿热之功。近年来用于健胃、抗肿瘤、治疗急慢性肝炎、乙型脑炎、甲状腺机能亢进等疾病亦取得良好疗效。

目前国内外对龙胆属植物的化学成分做了大量的分离鉴定、药理和临床研究，龙胆含有龙胆苦苷(gentiopic2rin)、当药苷(sweroside)、当药苦苷(swertiam a rin)等裂环环烯醚萜苷类、生物碱、黄酮、甾体、香豆素、内酯、糖及其苷类，酚性成分、微量元素、鞣质、蛋白质、挥发油、油脂类等化合物成分［1］。龙胆苦苷为其主要有效成分，且含量最高，被《中国药典》定为龙胆的质量控制目标成分，具有抗菌、抗炎、健胃和保肝利胆等作用［2－6］〕。其结构式如下

本文主要采用HPLC对HSCCC溶剂体系的分配系数的测定值和固定相保留率的测定值为依据，进行溶剂系统的筛选。再对HSCCC的转速和体积流量进行单因素考察，找出HSCCC最佳的转速和体积流量，以分离制备出高纯度龙胆苦苷。

1.仪器与试药

1.1 仪器

KQ－250DE型超声波清洗器

JMF－320多级闪蒸器

RE－3000旋转蒸发仪

SHZ－D(Ⅲ)型循环水式真空泵

DK－98－1型电热恒温水浴锅

GZX－DH－50X55－S型电热恒温干燥箱

高效液相色谱系统

TBE－300B高速逆流色谱仪

FA1104N电子天平

1.2 试药

龙胆苦苷标准品(纯度＞98%)批号为0912056，购自上海融禾医药科技有限公司;甲醇为色谱纯(美国fisher公司)乙醇、正丁醇、正己烷、乙酸乙酯、冰醋酸、乙酸铵均为分析纯，HPLC用水为娃哈哈纯净水。龙胆草产地为吉林。

2.实验方法

2.1 超声波提取

对原料龙胆草进行切段，段长1～2 cm，用天平称取切段后的龙胆草1 kg，用5倍体积乙醇常温浸泡12 h后，在25℃，250 W的条件下超声提取30 min，将提取溶液采用布氏漏斗进行过滤。以上操作重复3次，合并其滤液浓缩至浸膏［7］，真空干燥成粉末，制备后的龙胆苦苷样品储存于冰箱中备用。

2.2 HPLC测定龙胆苦苷的含量

2.2.1 色谱条件及系统适应性试验

色谱柱:Tigerkin ODS3(250 mm×4.6 mm，5μm);流动相:甲醇－0.1%磷酸溶液(24:76);检测波长:270 nm;流速:1.0 ml/min;进样量:10 μl;柱温:30℃。此色谱条件下，分离度＞1.5，理论塔板数在4000以上。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取10 mg龙胆苦苷标准品，置于10 ml容量瓶中，加甲醇超声溶解，用甲醇定容，配制成1mg/mL的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

精密称取龙胆提取物粉末50 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇定容配制成1 mg/mL的供试品溶液，超声提取15 min，冷却至室温，用微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液，备用。

2.3 HSCCC色谱条件

正丁醇－水(1:1)为溶剂体系，转速为850 r/min，然后以2 ml/min的流速泵入流动相，待流动相流出两相溶剂在柱中达到平衡状态时，通过进样阀注入样品，进样量0.200mg/20mL，280nm处紫外检测器进行检测，记录色谱图，收集流分。

3 结果与讨论:

3.1 超声波提取

计算得到龙胆草中龙胆苦苷的含量为0.5411%。

3.2 HPLC测定龙胆苦苷含量

3.2.1 检测波长的确定

取龙胆苦苷对照品溶液1.5 ml，以甲醇为空白，在紫外分光光度计下进行扫描，波长范围200～600 nm。结果表明，龙胆苦苷在270 nm波长处有最大吸收，故选择270 nm作为检测波长。

3.2.2 HPLC色谱条件的摸索

本实验曾选取不同比例的甲醇－水、甲醇－0.1%冰醋酸溶液、甲醇－0.2%乙酸铵溶液、甲醇－1%乙酸铵溶液、甲醇－0.1%磷酸等溶液作为流动相，以龙胆苦苷对照品及上述龙胆提取物在各条件下的分离度、理论塔板数为依据，最终确定最佳HPLC色谱条件为:色谱柱:Tigerkin ODS3(250 mm×4.6 mm，5μm);流动相:甲醇－0.1%磷酸溶液(24: 76);检测波长:270 nm;流速:1.0 ml/min;进样量:10 μl;柱温:25℃。最佳条件下龙胆苦苷对照品及龙胆草样品色谱图。见图1、图2。

图1 龙胆苦苷对照品(Figure 1 gentiopicroside reference substance)

图2 龙胆苦苷样品(Figure 2 Sample gentiopicroside)

3.2.3 加样回收率实验

精密称取9份龙胆提取物粉末，每份2.5 mg，分别置于5mL容量瓶中，加少量的甲醇超声溶解，再分别加入龙胆苦苷的对照品溶液0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL，以相同的色谱条件进样，测得结果如表3所示。

表1 回收率实验(n=9)(Table 3Test for recovery)

3.2.4 龙胆苦苷样品含量测定

按供试品溶液制备方法，制备3批龙胆苦苷提取物，按最佳色谱条件进行含量测定，结果见表4。

表2

3.3 HSCCC分离龙胆苦苷

3.3.1 溶剂系统筛选

溶剂系统的选择是高速逆流色谱应用的关键，采用高效液相色谱对高速逆流色谱溶剂体系的分配系数的测定值和固定相保留率的测定值为依据，进行溶剂系统的筛选。实验结果如表4、表5，

(1)以龙胆样品中龙胆苦苷在溶剂体系中的分配系数为参考依据进行筛选，按下列公式计算:

分配系数=溶质在固定相中的浓度CS/溶质在流动相中的浓度CM结果如表5所示:

表3

根据分配系数在0.5－2的范围内分离效果较好的原则选择进行高速逆流色谱分离。

(2)以溶剂体系的固定相保留率为参考依据进行溶剂的筛选，按下列公式计算:

固定相保留=(柱外流通管的死体积一管柱中推出的流动相体积)/管柱总体积

结果如表6所示:

表4

3.3.2 有效成分的分离

在最佳HSCCCC条件下。龙胆苦苷出峰时间为120.0－133.6min，固定相保留率36%，高速逆流色谱图(图4)

3.3.3 HPLC鉴定与检测纯度

将高速逆流色谱仪在120.0－133.6min收集到的组分HPLC检测，记录色谱图，并与龙胆苦苷对照品在同条件下的色谱图进行对比，确定HSCCC分离到得物质为龙胆苦苷，见图5和图6。

4.小结

通过含量测定得到龙胆草中龙胆苦苷的含量为0.5411%。采用高速逆流色谱分离制备龙胆中龙胆苦昔，研究试验得出:以正丁醇－水(1:1)为溶剂系统，上相作固定相，下相作流动相，转速为850 r/min，固定相保留率36%，主机正转，流速2 mL/min，龙胆苦昔出峰时间为120.0－133.6 min，经HPLC检测，纯度可达98%以上，是目前分离龙胆苦苷的首选方法，简便、快速、纯度高。

图3

图4 龙胆苦苷的对照品(Figure 7 the reference substance gentiopicroside)

图5 龙胆苦苷样品(Figure 8 Sample gentiopicroside)

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R943.1

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