Ras相关区域家族1A基因在喉癌及喉角化症组织中的表达及临床意义

李万举 孙敬武 别远志

喉癌是发生于喉黏膜上皮的恶性肿瘤，组织学上以鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)最常见，约占全部喉癌病例的95%～98%。喉鳞状细胞癌的发生过程中有许多致病因素在共同发挥作用，除了癌基因被激活外，一些因素引起的抑癌基因失活是另一个十分重要的因素[1]。Ras相关区域家族1A基因(Ras association domain family 1A, RASSF1A)是由Damman等[2]在2000年对肺癌组织的研究中发现的一种基因。目前认为，RASSF1A基因抑制肿瘤的机制是该基因干预细胞周期的进程，并可以抑制细胞生长、促进细胞凋亡。某些因素导致RASSF1A基因的启动子发生甲基化之后会进一步引起RASSF1A基因失活并最终导致组织细胞周期紊乱而发生癌变[3，4]。

喉角化症是喉部黏膜上皮生长、成熟异常以及黏膜上皮过度角化的一种增生性病变，目前喉角化症与成人喉乳头状瘤及慢性肥厚性喉炎均被认为是喉的癌前病变[5]。本研究拟通过对正常喉粘膜、喉角化症及喉鳞状细胞癌组织中RASSF1A的表达对比研究，初步探讨RASSF1A基因在喉角化症及喉鳞状细胞癌的发生发展过程中的意义。

1 材料与方法

1.1喉组织标本的采集及分组 收集自2009年12月到2012年12月安徽省立医院耳鼻咽喉头颈外科确诊并行手术中切除的喉鳞状细胞癌、喉角化症组织标本共74例为实验组，其中男68例，女6例，年龄23～77岁，平均47岁；分为2组：①喉鳞状细胞癌组织31例，其中男30例，女1例；高、中、低分化鳞癌分别为12、14及5例；I、II、III、IV期病例分别为9、5、11、6例；②喉角化症组织43例，其中男38例，女5例。对照组为从冷冻新鲜尸头标本取的正常声带黏膜8例。

1.2免疫组化染色方法 各组标本取材后以4%甲醛固定脱水后石蜡包埋制作切片，片厚4 μm。石蜡切片常规脱蜡，PBS洗3次各3分钟；滴加3%H2O2，37 ℃静置10分钟，PBS洗3次各3分钟；微波修复，高火5分钟，冷却后，重复一次；PBS洗3次各3分钟，滴加正常山羊血清封闭液，室温30分钟；滴加I抗(1：200稀释)50 μl/片，4 ℃过夜；过夜后室温复温20分钟，PBS洗3次每次5分钟，滴加II抗工作液50 μl/片，37 ℃ 30分钟；PBS洗3次各5分钟，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液50 μl/片，PBS洗3次各5分钟；DAB显色5～10分钟，在显微镜下观察染色程度；自来水冲洗后苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗10～15分钟；脱水、透明、封片、烤片后进行显微镜拍照。

1.4统计学方法 采用SPSS17.0统计分析软件对正常喉黏膜组、喉角化症组及喉鳞状细胞癌组的阳性细胞百分数进行单因素方差分析(one-way ANNOVA)，两组间比较用q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

RASSF1A在正常喉粘膜组织和喉角化症组织中呈强阳性表达(图1、2)，在喉鳞状细胞癌中呈弱阳性表达(图3～5)，其在正常喉粘膜、喉角化症及喉鳞状细胞癌组中的阳性细胞表达率分别为58.25%±8.89%、47.22%±2.35%及21.36%±10.98%；RASSF1A在喉鳞状细胞癌的表达低于喉角化症组织和正常喉组织，差异均具有统计学意义(P<0.05)；喉角化症组织中RASSF1A表达阳性率与正常喉粘膜组织比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 RASSF1A在正常喉黏膜中的表达呈强阳性(+++) (免疫组化×400)图2 RASSF1A 在喉角化症中的表达呈强阳性(+++) (免疫组化×400)图3 RASSF1A在喉癌中的表达(高分化鳞癌) 呈弱阳性(+) (免疫组化×400)图4 RASSF1A在喉癌中的表达(中分化鳞癌) 呈弱阳性(+) (免疫组化×400)图5 RASSF1A在喉癌中的表达(低分化鳞癌) 呈弱阳性(+) (免疫组化×400)

RASSF1A在I～IV期喉鳞状细胞癌组织中的表达呈逐渐下降趋势，各组间差异具有统计学意义(P<0.05) (表1)。而高分化、中分化及低分化鳞状细胞癌组织中RASSF1A阳性细胞表达率的比较，差异无统计学意义(表2)(P>0.05)。

表1 I～IV期喉癌组织中的RASSF1A阳性表达率比较(%)

表2 不同分化程度喉癌组织中的RASSF1A阳情表达率(%)

3 讨论

Ras相关区域家族1A(Ras association domain family1A,RASSF1A) 基因[6]定位于人类3p21.3染色体,由Damman等[2]在肺癌组织中分离得到。随后在多种肿瘤如鼻咽癌、淋巴瘤等恶性肿瘤组织中都发现了RASSF1A基因的异常表达，并有国内外学者对其进行了进一步深入的研究[6，7]。在Ras信号传导通路中，RASSF1A蛋白是一种参与细胞周期调控的重要抑制蛋白，它通过多种途径抑制细胞生长，促进细胞凋亡和衰老。其N端与富含半胱氨酸的甘油二酯结合区高度同源，也被称作蛋白激酶C保守区1(C1)。如果将RASSF1A转染入不表达该基因的癌细胞株，可以发现肿瘤细胞克隆的形成和非贴壁肿瘤细胞的生长受到明显抑制，接种于裸鼠后其成瘤生长能力也明显下降，由此确定了RASSF1A作为抑癌基因的作用[8]。

Jaroslaw等[9]对41例喉鳞状细胞癌组织进行相关研究后认为，RASSF1A可以阻断Ras-RASSF1-ERK通路的信号传导,使Ras生长效应信号不能够从细胞外转向细胞内,从而丧失促进细胞增殖、介导细胞分化和激活原癌基因的功能,通过这种机制来发挥抑制细胞癌变的作用。许承弼等[10]报道喉鳞状细胞癌组织中RASSF1A蛋白的表达强度明显低于癌旁组织和正常喉组织，提示喉鳞状细胞癌的发生与RASSFlA蛋白表达降低有关，并且认为RASSFlA的表达与喉鳞状细胞癌的临床分期有关，不同临床分期喉鳞状细胞癌组织RASSFlA蛋白的表达程度不同，临床分期越晚，RASSFlA蛋白表达水平越低，提示RASSFlA的表达与肿瘤的侵袭、转移有关。从本研究结果看，喉鳞状细胞癌组织中RASSF1A蛋白的表达低于正常喉组织，且I～IV期喉癌组织中其表达强度也逐渐降低，与上述文献相符，表明RASSFlA蛋白表达降低与喉鳞状细胞癌的发生及发展过程有关。 在本组所有喉鳞状细胞癌组织中，高分化、中分化及低分化癌组织中RASSF1A表达水平无明显差异，表明喉鳞癌的细胞分化水平与RASSF1A基因表达水平无关，说明RASSF1A基因作为一种抑癌基因，发生缺失或突变后可导致细胞癌变，但并不能决定癌细胞的分化程度。

郭伟等[11]在对喉癌及癌前病变中细胞周期调控基因甲基化的研究中发现，细胞周期调控基因p14、p15及p16基因启动子及甲基化在正常喉组织、喉角化症及喉鳞状细胞癌组织中基因启动子过甲基化及蛋白表达水平呈逐渐变化的趋势，说明在喉黏膜组织由正常向癌前病变进而转变为恶性肿瘤过程中，与相关基因的异常表达有关。本研究发现，在喉角化症组织中，RASSF1A蛋白表达低于正常喉黏膜组织，差异无统计学意义，不能认为抑癌基因RASSF1A基因的表达降低与喉角化症的发生有关；但是，RASSF1A基因在喉鳞状细胞癌组织中的阳性表达率高于喉角化症组织，至少提示RASSF1A基因可能参与了喉鳞状细胞癌发生的早期过程，可将其作为喉鳞状细胞癌的早期预警指标，在鉴别某一喉部病变是否已由癌前病变恶变为喉癌时可能有一定意义。

综上所述， RASSFlA蛋白在喉癌组织中的表达强度明显低于正常喉组织，且临床分期越晚，表达强度越低，提示该蛋白表达降低与喉鳞状细胞癌的发生发展可能有关；对RASSFlA蛋白表达水平进行检测，有助于筛查RASSFlA基因异常的人群，提高喉鳞状细胞癌的早期诊断水平，并对鉴别癌前病变与喉癌有一定意义。

4 参考文献

1 Oh JJ,Taschereau EO,Koegel1 AK, et al. RBM5/H37 tumor suppressor, located at the lung cancer hot spot 3p21.3,alters expression of genes involved in metastasis[J]. Lung Cancer,2010,70:253.

2 Damman R,Li C,Yon PL,et al.Epigenetic inactivation of a RAS association domain family protein from the lung tumour suppressor locus 3p21.3[J].Nat Genet,2000,25:315.

3 Lin HH,Ke HL,Huang SP,et al.Increase sensitivity in detecting superficial,low grade bladder cancer by combination analysis of hypermethylation of E-cadherin,p16,p14, RASSF1A genes in urine[J].Urologic Oncology:Seminars and Original Investigations,2010,28:597.

4 Peter H,Christoph L,Esther H,et al.Frequent hypermethylation of RASSF1A tumour suppressor gene promoter and presence of Merkel cell polyomavirus in small cell lung cancer[J]. European Journal of Cancer,2009,45:2 207.

5 Franco RA.Aminolevulinic acid 585nm pulsed dye laser photodynamic treatment of laryngeal keratosis with atypia[J]. Otolaryngology Head and Neck Surgery,2007,137:882.

6 Lee VHY, Chow BKC, Lo KW,et al.Regulation of RASSF1A in nasopharyngeal cells and its response to UV irradiation[J].Gene,2009,443:55.

7 Richter AM,Undraga S,Matthias R,et al. Protein kinase A-mediated phosphorylation of the RASSF1A tumour suppressor at Serine 203 and regulation of RASSF1A function[J].European Journal of Cancer,2010,46:2 986.

8 Thapar R，Williams JG, Campbell SL, et al. NMR Characterization of full-length farnesylated and non-farnesylated h-Ras and its implications for raf activation[J]. J Mol Biol,2004,343:1 391.

10 许承弼, 滕博, 李长青,等. 喉鳞状细胞癌中RASSF1A基因启动子区甲基化及蛋白表达[J].吉林大学学报,2006,32:326.

11 郭伟,黄志刚,陈晓红,等.喉癌及癌前病变中细胞周期调控基因甲基化的研究[J].中国耳鼻咽喉头颈外科杂志,2009,16:11.