阿维菌素纳米脂质体在山羊体内的药动学研究

孙雪峰，张要齐，许贤会，党丽梅，刘 丹，李会芳，刘一霖，李引乾＊

（1.河南惠通天下动物药业有限公司，河南郑州450000；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌712100）

阿维菌素（avermectin，AVM）是阿维链霉菌发酵的天然产物，主要成分为avermectin B1，国外又称爱比菌素（abamectin）。兽用阿维菌素是由我国首先研究开发的，由于价格低于伊维菌素，很快在我国得到推广应用［1-3］。阿维菌素是一种大环内酯类抗生素，具有广谱的杀线虫和外寄生虫作用，已广泛用于家畜寄生虫病的治疗，其剂型有预混剂、片剂、糊剂、口服液、注射剂和浇泼剂，这些制剂可以不同程度的满足不同种类动物和不同饲养方式下的用药需求［4-6］。阿维菌素具有高效、广谱、低残留和对人畜及环境安全等特点，是一种重要的绿色生态型农畜两用新型抗生素［7-8］。脂质体是一种新型的载药系统，由于脂质体具有靶向性、淋巴定向性、缓释作用、降低药物毒性和提高稳定性等特性，已经成为目前各种药物缓释和控释制剂等研究领域的热点［9-10］。目前国内外已经研制出了许多药物的脂质体剂型并应用到了临床实践中。

阿维菌素由于分子质量大，极难气化，所以无法使用气相色谱分析，目前的检测方法有HPLC 方法和免疫分析方法［11］。本文应用HPLC法对阿维菌素纳米脂质体（avermectin nanometre liposomes，AVMNL）在山羊体内的药动学研究，旨在评价其体内释药规律，为阿维菌素长效控释剂的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器设备 LCQ-ADUANFAGE 高效液相色谱仪为美国FINNGAN 公司产品；Ausphere ODS-2色谱柱为美国安捷伦科技有限公司产品；BS 210S型电子分析天平为德国赛多利斯（sartorius）股份公司产品；QL-901 Vortex漩涡振荡器为其林贝尔仪器制造公司产品；隔水式电热恒温培养箱为上海市跃进医疗器械一厂产品；DRAGON-MED 10μL ～100 μL微量移液器、DRAGON-MED 100μL～1 000μL微量移液器为大龙医疗设备有限公司产品。

1.1.2 试剂 阿维菌素标准品、阿维菌素（B1a含量为94.08%，B1含量为97.72%）为河北威远动物药业有限公司产品，批号：2012043100；阿维菌素纳米脂质体（10g／L）为西北农林科技大学药理研究室试制，批号：20130427；乙酸乙酯、甲醇、色谱纯，为天津市科密欧化学试剂有限公司产品（批号：20130105）。

1.1.3 试验用动物 用健康山羊5 只（3 只公羊，2只母羊），体重30kg～38kg，试验前常规饲养7d，临床检查健康者，即为试验羊。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件的确定

1.2.1.1 检测波长的选择 对阿维菌素标准液进行全波长扫描，以其最大吸收波长作为阿维菌素的测定波长［12］。

1.2.1.2 色谱分析条件选择 色谱柱选择Welchrom-C18柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相为乙腈-甲醇-水（53∶35∶12，V／V／V），流速为1.0mL／min，柱温30 ℃，进样量为20μL。

1.2.2 生物样品预处理

1.2.2.1 血清的分离 在山羊颈静脉采血4.5mL，置于10mL 离心管中，加入柠檬酸钠抗凝剂0.5mL，6 000r／min条件下离心10min，分离上清液备用。

1.2.2.2 血清样品的处理 参照文献［13-14］取血清样品1.0mL置于5 mL 离心管，加入乙酸乙酯1.0mL，漩涡混匀5 min，6 000r／min 条件下离心15min，取上清液备用。在下层液中再加入乙酸乙酯0.5mL，按同上操作共3次（乙酸乙酯1.0、0.5、0.5mL）。6 000r／min条件下离心15 min，合并上层液，将上清液在50 ℃水浴N2流吹干。残留物加0.5mL甲醇溶解，漩涡混合5min，用0.22μm 滤膜过滤后，进样测定。

1.2.2.3 标准曲线的制备 精密称取阿维菌素对照品置容量瓶中，加甲醇溶解配置成1μg／mL 的标准溶液。取7支5 mL 洁净离心管各加入1.0 mL山羊空白血清，再分别依次加入阿维菌素标准液制备成2.0、5.0、10.0、25.0、100.0、150.0ng／mL 的血药浓度，漩涡混匀，按照1.2.2.2项的方法处理样品后，取20μL进样分析。记录色谱峰面积，回归计算出标准曲线方程。

1.2.2.4 精密度测定 取空白血清3 份（每份各1.0mL），加入适量阿维菌素标准液，制备成10.0、50.0、150.0 ng／mL的血药浓度，漩涡混 匀，按1.2.2.2方法处理后，在1d内重复测定3次，即得日内精密度；将上述3种浓度的样品在5d内隔日重复测定3次，即得日间变异系数。

1.2.2.5 回收率的测定 取空白血清3 份（各1.0mL），加入适量阿维菌素标准液，制备成10.0、50.0、150.0 ng／mL的血药浓度，漩涡混 匀，按1.2.2.2方法处理后，重复测定含量3次，以添量法计算相对回收率。

1.2.2.6 给药方法及采血 以1.2mg／kg的剂量给山羊颈部皮下注射阿维菌素纳米脂质体。给药前颈静脉采血4.5mL，加入柠檬酸钠抗凝剂0.5mL作为空白对照，给药后0.04、0.17、0.29、0.5、1、2、4、6、8、12、16、20、22、24、28、30d颈静脉采血4.5mL，并分别加入抗凝剂0.5mL。按1.2.2.1的方法分离血清，置-20 ℃冰箱保存至测定。

1.2.2.7 血清中阿维菌素浓度的测定 将各时间点采取的血清样品按1.2.2.2方法处理后，取20μL进样分析，记录色谱峰面积，代入标准曲线方程计算出血清中阿维菌素的浓度。

1.2.2.8 药物动力学参数计算 逐只山羊拟合药时曲线，方差分析优选模型，计算动力学参数。

2 结果

2.1 阿维菌素标准品液相色谱图

对阿维菌素标准液进行全波长扫描，发现其在254nm 处有最大吸收，故选择254nm 为阿维菌素的检测波长。阿维菌素标准品的液相色谱图（图1），出峰时间为3.117min，且峰型较好。

图1 阿维菌素标准品液相色谱图Fig.1 The HPLC chromatogram of avermectin standard

2.2 标准曲线

结果表明，血清中阿维菌素在2.0ng／mL～150.0ng／mL浓度范围内与峰面积有良好的线性关系，y＝1 555.8x＋222 353，r＝0.999 1。以血药浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标绘制的标准曲线见图2。

图2 阿维菌素标准曲线Fig.2 The standard curve of avermectin

2.3 精密度试验结果

血清中阿维菌素高、中、低3种浓度的日内变异系数均小于5%，日间变异系数均小于10%，符合要求，结果见表1。

2.4 回收率试验结果

血清中阿维菌素高、中、低3种浓度的回收率均在90%～110%之间，符合要求，结果见表2。

表1 血清中阿维菌素的精密度测定结果Table 1 The precision of avermectin in serum

表2 血清中阿维菌素的回收率测定结果Table 2 The recovery rate of avermectin in serum

2.5 血药浓度结果

山羊皮下注射阿维菌素纳米脂质体后不同时间的血药浓度结果见表3

2.6 药时曲线方程

对5只山羊皮下注射阿维菌素纳米脂质体的药时曲线血药数据均符合一室模型，药时曲线见图3。

2.7 药动学参数

山羊皮下注射阿维菌素纳米脂质体后的主要药物动力学参数见表4。

3 讨论

高效液相色谱法具有很高的特异性、灵敏度及较快的检测速度［15］。适用于大分子、高沸点和热稳定性差的化合物。由于动物及其产品成分较为复杂，干扰性杂质较多，采用该法检测时，应谨慎预处理待测样品，以提高测定的灵敏度与准确性。处理样品时，在50 ℃水温中用氮气流吹干所需时间较短，有利于阿维菌素的稳定［16］。因为阿维菌素极易溶于乙酸乙酯，在回收率测定试验中，其回收率高达95%以上，所以样品预处理的方法可靠。结果显示，吸收半衰期t1／2Ka＝0.24±0.03d，消除半衰期t1／2Ke＝6.74±0.80d，最高药物浓度Cm＝60.76±5.62ng／mL，药时曲线下面积AUC＝664.35±28.14（ng／mL）·d，达峰时间tp＝1.20±0.08d，药效可维持30d以上。说明该药物在山羊体内到达全身循环的总药量较高，而且能再山羊体内维持较长时间的有效血药浓度。

表3 山羊皮下注射阿维菌素纳米脂质体后不同时间的血药浓度Table 3 Serum concentration of avermectin in goats after subcutaneous injection of avermectin nanometre liposomes ng／mL

图3 阿维菌素纳米脂质体药时曲线图Fig.3 The blood concentration-time curve of AVMNL

表4 阿维菌素纳米脂质体在5只健康山羊体内的药物动力学参数Table 4 The pharmacokinetics parameters of avermectin nanometer liposomes in five healthy goats

广谱抗寄生虫药在体内的持效时间取决于其在动物体内的吸收、分布和血液／组织之间的分配。药物在体内吸收、分布和血液／组织之间的分配方面的细微变化都可能导致药物在寄生虫寄生部位浓度和维持时间的较大改变，进而改变药物的抗虫活力与持效时间［17］。阿维菌素是脂溶性较高，经纳米脂质体包封后，可达到延缓吸收的效果，并且长时间维持有效的血药浓度。潘保良等［18］研究表明，普通阿维菌素注射液的维持有效血药浓度的时间不足21d，而本试验测定阿维菌素纳米脂质体维持药效可达30 d以上，表明纳米脂质体作为一种新型兽用药物制剂，AVMNL的缓释效果已初步确定，但对该制剂的质量标准、药效、体内各个组织的分布状况尚需要继续研究。

［1］陈杖榴.兽医药理学［M］.3 版.北京：中国农业出版社，2009：313-314.

［2］秦改晓，徐文彦，艾晓辉，等.单剂量口灌阿维菌素在草鱼体内的药动学及残留研究［J］.淡水渔业，2012，42（4）：47-52.

［3］Zhu Wen-jun，Li Ming，Liu Ci，et al.Avermectin induced liver injury in pigeon：Mechanisms of apoptosis and oxidatative stress［J］.Ecotoxicology and Environmental Safety，2013，98：74-81.

［4］易金娥，袁 慧，袁莉芸，等.阿维菌素微囊对大鼠急性和亚慢性毒性试验［J］.动物医学进展，2008，29（2）：27-30.

［5］Chen L J，Sun B H，Qu J P，et al.Avermectin induced inflammation damage in king pigeon brain［J］.Chemosphere，2013，93（10）：2528-2534.

［6］Su W K，Hou Z N，Liang X R.Separation of avermectin components from streptomyces avemitilis extraction using highspeed counter-current chromatography［J］.Chemical Industry＆Chemical Engineering Quarterly，2013，19，4：563-571.

［7］刘耀川，赵 刚，宁 静，等.阿维菌素的研究进展［J］.现代畜牧兽医，2012（1）：60-62.

［8］李 铭，冯 伟，李 术.阿维菌素类药物对非靶动物毒理学的研究进展［J］.东北农业大学学报，2013，44（12）：126-130.

［9］陆 彬.药物新剂型与新技术［M］.北京：人民卫生出版社，1998：123-125.

［10］Peter S，Stefan W，Caroline H，et al.Membbrane protein reconstitution into liposomes guided by dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy［J］.Biophys Chem，2013，184：37-43.

［11］何继红，申屠芬琴.阿维菌素类药物残留分析技术研究进展［J］.动物医学进展，2009，30（5）：98-100.

［12］中国兽药典委员会编.中华人民共和国兽药典［M］.2010：88-89.

［13］王敏儒，陈杖榴，冯淇辉.伊维菌素微球在家兔体内的药动学［J］.畜牧兽医学报，2000，31（2）：171-178.

［14］扈洪波，朱蓓蕾，李俊锁.阿维菌素类驱虫药的药代动力学研究［J］.中国兽医杂志，1998，24（5）：51-53.

［15］陈 曦 王观悦 徐宗香，等.黏菌素HPLC 分析方法的研究进展［J］.中国畜牧兽医文摘，2012，28（6）：39-40.

［16］任志红，孟 慧.酮康唑微囊在兔体内的药动学研究［J］.第二军医大学学报，2006，27（7）：796-798.

［17］Alvinerie M，Sutra J F，Galtier P，et al.Pharmacokinetics of eprinomectin in plasma and milk following topical administration to lactating airy cattle［J］.Res Vet Sci，1999，67：229-232.

［18］潘保良，王玉万，汪 明.阿维菌素长效注射液（油悬剂）与普通注射液在绵羊体内的药代动力学比较研究［J］.中国兽药杂志，2003，37（3）：18-21.