新型铁系金属(M=Ni，Co)配合物的合成及其与DNA的相互作用*

段冉冉，王璐，霍炜强，陈实，1b，周晓华，1b

(1.华南农业大学a.理学院应用化学系;b.生物材料研究所，广东 广州 510642)

新型铁系金属(M=Ni，Co)配合物的合成及其与DNA的相互作用*

段冉冉1a，王璐1a，霍炜强1a，陈实1a，1b，周晓华1a，1b

(1.华南农业大学a.理学院应用化学系;b.生物材料研究所，广东 广州 510642)

以1，10-邻菲罗啉(Phen)和2，4-二氨基-6-(2-吡嗪)-均三嗪(DAPT)为配体，与铁系金属(M=Ni，Co)盐反应合成了两个新型的金属配合物——［Ni(Phen)(DAPT)Cl2］·3H2O(3a)和［Co(Phen)(DAPT)Cl2］·3H2O (3b)，其结构和性能经IR，LC-MS，元素分析，TG-DTA和摩尔电导率表征。用UV-Vis、溴化乙锭荧光竞争光谱、相对粘度、电化学、DNA热变性及盐效应等方法研究了3a和3b与小牛胸腺DNA(ct-DNA)的相互作用。实验结果表明:3a和3b与ct-DNA的结合模式均为插入模式;3a与ct-DNA的结合强度略大于3b。

金属(II)配合物;邻菲罗啉;均三嗪;合成;DNA;作用模式

邻菲罗啉(Phen，1)及其衍生物具有刚性平面结构，可快速插入到DNA或RNA中与其结合［1-2］，对某些肿瘤有较强的抑制作用，其金属配合物的抗癌活性更高［3-4］，Phen-Cu(II)配合物还具有化学核酸酶活性以及对DNA分子序列的选择性。1979年，Sigman等［5］就报道了Cu能切割DNA。倾向于在小沟5'-TAT序列上切割脱氧核苷的糖环，使DNA的螺旋结构发生扭曲，这种切割作用有利于Phen的渗透并与DNA链产生插入或沟槽结合作用［6-7］。

2，4-二氨基-6-(2-吡嗪基)均三嗪(DAPT，2)是具有较大共轭体系的氮杂芳环化合物，其多氮结构具有很强的氢键识别性，常常用作DNA印记识别分子。1988年，Asanuma等［8］报道了具有类似三嗪结构的PVDAT可以在水中识别核酸的碱基及衍生物，并与不同碱基形成不同的氢键作用; Slinchenko等［9-10］证明了4，6-二氨基-1，3，5-三嗪(DAT)及其衍生物对DNA双链的A-T碱基具有识别作用的主要原因在于DAT结构可以通过氢键与DNA中富含大量氢键受体和供体的碱基产生作用。

综上可见，1及其衍生物与过渡金属形成的配合物可以用作核酸切割酶，进而有一定的抗癌活性;2及其过渡金属配合物对DNA碱基序列具有识别作用。因此，在DNA的识别和修复中，结构类似于［M(Phen)L］2+的配合物能够插入并堆积到DNA双螺旋碱基对中间［11-12］。合成以1和2为配体的三元金属配合物并研究其与DNA的相互作用，对筛选DNA靶向抗癌药物具有一定的意义。

为此，本文以1和2为配体，与铁系金属(M= Ni，Co)盐反应合成了两个新型的金属配合物——［Ni(Phen)(DAPT)Cl2］·3H2O(3a)和［Co(Phen) (DAPT)Cl2］·3H2O(3b)(Chart 1)，其结构和性能经IR，LC-MS，元素分析，TG-DTA和摩尔电导率表征。用UV-Vis［13］、溴化乙锭荧光竞争光谱、相对粘度、电化学、DNA热变性及盐效应等方法研究了3a和3b与小牛胸腺DNA(ct-DNA)的相互作用。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Shimadzu UV-2550型紫外/可见分光光度计; Nnicolet ACATAR 360型红外光谱仪(KBr压片); Agilent6430型质谱仪(甲醇为溶剂);ELEMENTAR Vario EL型元素分析仪;DDS-12A型电导率仪(扫描速度50 mV·S-1，扫描电位1.0 V～-1.0 V);HITACHIF-4500型荧光光谱仪(λex= 510 nm，扫描速度240 nm·s-1);CHI-6600型电化学工作站。

2按文献［14］方法合成;ct-DNA，Sigma试剂公司;其余所用试剂均为分析纯，上海国药试剂公司;实验用水为重蒸馏水。

1.2 3a和3b的合成

在反应瓶中依次加入NiCl2·6H2O 237.7 mg (1 mmol)，1 198.2 mg(1 mmol)，2 188.0 mg(1 mmol)和适量乙醇，搅拌使其溶解;用20%NaOH溶液调至pH 6.2，搅拌下于70℃(回流)反应2 h。冷却至室温，静置析晶，过滤，滤液缓慢挥发后析出绿色晶体，过滤，滤饼干燥得绿色固体3a 410.3 mg，收率72%;UV-Vis(CH3OH，下同) λmax:269 nm;IRν:3 258，3 136，1 616，1 518，1 045，810，727 cm-1;TG(weight loss%):Calcd for［Ni(Phen)(DAPT)Cl2］·3H2O:H2O 9.87，Cl 12.68，Phen 32.65，DAPT 34.36;found H2O 9.78，Cl 12.86，phen 32.09，DAPT 34.24;ESMS m/z:Calcd for C19H19N9O2Cl2Ni{［M++Cl］-} 464.1，found 464.14;Anal.calcd for C19H19N9O2Cl2Ni:C 41.27，H 3.76，N 23.25;found C 41.25，H 3.83，N 23.78。

用CoCl2·6H2O替代NiCl2·6H2O(乙腈为溶剂，pH 5.8)，用类似的方法合成暗红色固体3b 392.4 mg，收率69%;UV-Visλmax:269 nm;IR ν:3 114，3 298，1 628，1 514，1 062，825，717 cm-1;TG(weight loss)(%):Calcd for［Co(Phen) (DAPT)Cl2］·3H2O:H2O 9.69，Cl 12.77，Phen 32.58，DAPT 33.96;found H2O 9.78，Cl 12.87，Phen 32.09，DAPT 34.24;ES-MS m/z:Calcd for C19H19N9O2Cl2Co{［M++Cl］-}464.4，found 464.3; Anal.calcd for C19H19N9O2Cl2Co:C 40.82，H 3.71，N 23.41;found C 41.26，H 3.83，N 23.79。

1.3 性能测定

(1)电子吸收光谱

以Tris-HCl/NaCl缓冲溶液为空白液，测定配合物在200 nm～400 nm处的电子吸收光谱。分别在空白池和样品池中加入等体积的ct-DNA溶液，于室温反应2 h，测定其在200 nm～400 nm处的电子吸收光谱。同理测定不同浓度比的配合物/ct-DNA溶液的电子吸收光谱。

(2)荧光光谱

将溴化乙啶(EB，3μmol·L-1)与ct-DNA (1.2μmol·L-1)加入3 mL Tris-HCl/NaCl缓冲溶液中，静置4 h。测定EB/ct-DNA溶液在510 nm～710 nm处的荧光强度。仅改变配合物的量，于室温反应15 min，测定不同浓度配合物/ct-DNA/EB溶液在510 nm～710 nm处的荧光强度。

(3)粘度实验

将ct-DNA溶液(0.12 mmol·L-1)与不同浓度的配合物混匀，静置1 h，用乌氏粘度计于29.0℃±0.1℃测定其粘度，按下式计算相对粘度:

式中:t为ct-DNA溶液(含有不同浓度的配合物)流经毛细管所需的时间;t0为缓冲溶液流经毛细管所需的时间

ct-DNA溶液相对粘度随配合物加入量的变化以(η/η0)1/3对c(3)/c(ct-DNA)作图表示(η0为未加配合物时ct-DNA溶液的相对粘度)

(4)热变性实验

在UV-Vis分光光度计的样品池中加入3.0 mL ct-DNA溶液(70μmol·L-1)或含配合物(10 μmol·L-1)的ct-DNA溶液(70μmol·L-1)，以磷酸盐缓冲液为参比，升温速率1℃·min-1)，于42℃～92℃内，每升高2℃，记录ct-DNA溶液在260 nm处的吸光度A260。ct-DNA的熔点(Tm)，通过A260对温度T作图。

(5)电化学实验

在含配合物(80μmol·L-1)的缓冲溶液中，逐渐增加ct-DNA浓度，测试循环伏安曲线。

(6)盐效应实验

在含配合物(10μmol·L-1)的ct-DNA溶液(10μmol·L-1)中依次加入不同浓度的NaCl溶液，待反应达到平衡，测定配合物/ct-DNA/NaCl溶液的荧光强度。

2 结果与讨论

2.1 表征

(1)UV-Vis

在UV-Vis光谱(图略)中，1和2的甲醇溶液分别在265 nm和275 nm处有吸收峰，3a和3b的甲醇溶液在269 nm处出现较强吸收峰，这些吸收峰归属芳环的π→π*跃迁。与1和2相比，3a和3b的最大吸收峰位置发生了偏移，强度增强，这是两个配体吸收峰叠加的结果。

(2)IR

IR分析表明，3a和3b在3 300 cm-1附近均有特征吸收峰，这是结晶水的-OH振动峰;3 110 cm-1～3 140 cm-1处的中强度吸收峰归属2; 1 620 cm-1，720 cm-1和820 cm-1处的中强吸收峰是1的芳环振动峰和C-H振动峰;1 510 cm-1附近的吸收峰是2的C=N伸缩振动峰，说明1和2均参与配位。

(3)ES-MS

ES-MS分析表明，3a和3b分别出现正离子峰464.1和464.3，说明两个配合物中分别有离子碎片［Ni(Phen)(DAPT)Cl］+和［Co(Phen) (DAPT)Cl］+。

(4)元素分析

元素分析的理论值和测试值基本吻合，由此可以推断配合物的组成与实际相符合。

(5)TG-DTA

TG测试结果表明:在100℃以内出现失结晶水放热峰，失重率与推测结果吻合，说明两个配合物分子中3个H2O位于外界，没有参与配位。TG-DTA曲线一共出现四次质量变化的平台，分别对应H2O(50℃～100℃)，Cl(100℃～200℃)，1(350℃～465℃)和2(450℃～600℃)的失去，其失重率都与配合物的组成式基本吻合。

(6)摩尔电导率

在甲醇溶液中，3a和3b的摩尔电导率分别为12.4 S·m2·mol-1和13.6 S·m2·mol-1，说明他们均为非电解质［15］。

综合以上分析结果，推测配合物的分子式分别为［Ni(Phen)(DAPT)Cl2］·3H2O(3a)和［Co (Phen)(DAPT)Cl2］·3H2O(3b)，可能的分子结构如Chart1所示。

2.2 配合物与ct-DNA的相互作用

(1)电子吸收光谱

3a，3b和EB分别与ct-DNA相互作用的电子吸收光谱见图1。由图1可见，EB/ct-DNA溶液的UV-Vis谱图出现了明显的减色效应与红移现象。3a/ct-DNA和3b/ct-DNA溶液也都出现了明显的减色效应和轻微的红移(分别为3 nm和4 nm)，说明3a和3b与EB类似，通过插入方式与ct-DNA结合。通过文献［16］方法计算3a，3b和EB与ct-DNA嵌插作用的结合常数分别为1.7× 105，1.0×105和8.0×105，说明与ct-DNA嵌插作用的强弱顺序为:EB＞3a＞3b，且3a和3b与ct-DNA的结合强度接近。

图1 3a，3b和EB在不同浓度ct-DNA溶液中的电子吸收光谱*Figure 1 Absorption spectra of 3a，3b and EB with ct-DNA*c(3a)=20μmol·L-1，c(3b)=10μmol·L-1，c1(DNA)= (0，1，2，3，5，7，10，15)μmol·L-1，c(EB)=2μmol·L-1，c2(DNA)=(0，0.05，0.2，0.4，0.6，0.8，1)μmol·L-1

(2)荧光光谱

3a，3b分别和EB竞争的荧光光谱见图2。由图2可见，随着配合物的浓度的增加，其溶液的荧光强度大幅度降低。这是可能是由于3a和3b插入ct-DNA碱基对使ct-DNA双链有一定的扭曲变形，EB从碱基对间逸出使体系荧光发生淬灭。通过Stem-Volmer方程［17］方法计算出3a和3b的荧光猝灭常数分别为2.2×105和1.1×105。说明3a和3b对ct-DNA有一定的插入作用，且3a与ct-DNA的作用力略强于3b。

图2 3a或3b对EB/ct-DNA溶液荧光光谱的影响*Figure 2 Effects of 3a or 3b to EB/ct-DNA on emission spectra*c(DNA)=12μmol·L-1; c(3a)/c(DNA)=0，0.1，0.2，0.3，0.5，0.6，0.9，1.2; c(3b)/c(DNA)=0，0.1，0.2，0.3，0.5，0.7，0.8

(3)粘度实验

配合物以静电、沟面结合等方式与DNA作用时，DNA溶液的粘度基本不发生明显变化。配合物以插入方式与DNA作用时，DNA的双螺旋会伸长，溶液的相对粘度增大。以插入剂EB和沟槽剂Hoechst 33258为参照，ct-DNA溶液相对粘度随着配合物加入的变化见图3。由图3可见，随着EB，3a和3b的加入，ct-DNA溶液的相对粘度逐渐增加。而随着Hoechst 33258的逐渐加入［18］，ct-DNA溶液的相对粘度无明显变化，由此可判断3a和3b与ct-DNA的结合模式不同于沟槽剂Hoechst 33258，应是插入模式。根据ct-DNA溶液相对粘度的变化幅度推测出他们与ct-DNA作用的强弱顺序为:EB＞3a＞3b＞Hoechst33258。

图3 3a，3b对ct-DNA溶液相对粘度的影响Figure 3 Effects of3a or 3b to viscosity of ct-DNA

(4)热变性实验

化合物与DNA以插入方式结合时，由于插入试剂与DNA间的π-π堆砌作用，使DNA的Tm增高［19-20］;化合物与DNA以非插入方式结合时，Tm不变或变化不显著。3a和3b与ct-DNA作用的热变性曲线见图4。由图4可见，加入3a和3b后，ct-DNA的Tm由67℃分别增到74℃和76℃，表明3a和3b都是以插入方式和ct-DNA结合，且插入的强弱顺序为:3a＞3b。

图4 3a或3b与ct-DNA作用的热变性曲线Figure 4 Effect of 3a or 3b to thermostability of ct-DNA

(5)电化学实验

配合物与DNA作用后氧化还原峰电位负移，则发生静电作用;配合物与DNA作用后其电位正移，则发生插入作用［21-22］。图5是配合物/ct-DNA的循环伏安曲线。由图5可见，加入ct-DNA后，峰电流降低，同时电流的峰位有明显的正移，说明配合物与ct-DNA发生了插入作用。根据峰电流降低的幅度，推测3a与ct-DNA的结合强度大于3b。

(6)盐效应实验

离子强度对配合物/DNA复合体系的荧光光谱的影响可以判断配合物与DNA之间是否有静电作用［23-24］，不同浓度NaCl对配合物与ct-DNA复合体系的荧光强度影响见图6。

图5 3a或3b对ct-DNA溶液循环伏安曲线的影响Figure 5 Effects of 3a or 3b to ct-DNA on cyclic voltammetry curves

图6 NaCl对3a或3b/ct-DNA溶液荧光强度的影响Figure 6 Effects of NaCl to 3a(or 3b)/ct-DNA on FL intensities

由图6可见，随着c(NaCl)的增大，3a和3b的荧光强度都没有发生明显变化，由此可以推断3a和3b与ct-DNA均无静电作用。

3 结论

配体1和2与铁系金属(M=Ni，Co)盐反应合成了两个新型的金属配合物［M(Phen) (DAPT)Cl2］·3H2O(3a，3b)。用UV光谱法、溴化乙锭荧光竞争光谱法、相对粘度法、电化学法、DNA热变性法及盐效应法研究了3a和3b与ct-DNA的作用模式。实验结果表明:3a和3b中的配体皆以插入方式与DNA结合，且3a与ct-DNA的插入作用略强于3b，这可能是由于Ni(II)比Co(II)多1个3d电子，配合物中存在d-p反馈π键，3a的π电子云密度略高于3b的缘故。

以上结论对抗癌药物筛选和DNA分子识别有一定帮助。配合物对DNA的结合位点、序列选择性及其抗菌抗癌活性有待进一步研究。

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Synthesis of Two Novel Metal(M=Ni，Co)Complexes and Their Interaction with DNA

DUAN Ran-ran1a，WANG Lu1a，HUOWei-qiang1a，CHEN Shi1a，1b，ZHOU Xiao-hua1a，1b
(a.Department of Applied Chemistry，College of Science;b.Institute of Biomaterial，1.South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

Two novelmetal(M=Ni，Co)complexes，［Ni(Phen)(DAPT)Cl2］·3H2O(3a)and［Co (Phen)(DAPT)Cl2］·3H2O(3b)，were synthesized by coordination of 1，10-phenanthroline(Phen) with 2，4-diamido-6-(2-pyrazine)-1，3，5-triazine(DAPT)and Nickel(Ⅱ)or Cobalt(Ⅱ).The structures and propertieswere characterized by IR，LC-MS，elemental analysis，TG-DTA and molar conductivity.The interaction of 3a，3b with calf thymus DNA(ct-DNA)were investigated by UVVis，EB competition FL，relative viscosity，cyclic voltammetry，DNA thermal denaturation and salt effectsmethod.The results showed that the interaction models of3a and 3b with ct-DNA were intercalativemodel;3a exhibited stronger affinity force compared with 3b.

metal complex;1，10-phenanthroline;triazine;synthesis;DNA;interaction model

O614.81;O621.3

A

1005-1511(2014)02-0168-06

2013-10-09;

2014-01-20

广东省科技计划资助项目(2010B020311010);华南农业大学“211工程”三期重点建设项目

段冉冉(1987-)，女，汉族，山东枣庄人，硕士研究生，主要从事生物无机化学的研究。

周晓华，副教授，E-mail:zhouxiaohua1970@163.com