尼日菌素对前列腺癌DU145细胞Wnt/β-catenin信号传导的影响

游哲斌金润森

作者单位：350001 福州1福建省立医院干部特诊一科，福建医科大学省立临床医学院；200025 上海2上海交通大学医学院附属瑞金医院外科

基础研究

尼日菌素对前列腺癌DU145细胞Wnt/β-catenin信号传导的影响

游哲斌1金润森2

作者单位：350001 福州1福建省立医院干部特诊一科，福建医科大学省立临床医学院；200025 上海2上海交通大学医学院附属瑞金医院外科

目的 研究尼日菌素对前列腺癌DU145细胞的作用及其对Wnt/β-catenin信号传导的影响。方法 体外使用5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L的尼日菌素处理前列腺癌DU145细胞，同时以DMSO处理作为对照组。用细胞增殖-毒性检测试剂盒（CCK-8）检测尼日菌素对DU145细胞增殖活力的影响。以Transwell迁移侵袭实验检测药物对细胞的迁移侵袭能力的影响。用Western免疫印迹技术、免疫荧光及TOP/FOP-flash荧光报告试验检测尼日菌素对DU145细胞中β-catenin蛋白的表达及其下游靶基因c-myc及cyclin D1的表达以及对TCF/LEF转录因子活性的影响。结果 尼日菌素对前列腺癌DU145细胞有明显的细胞毒性作用，可以抑制其侵袭和转移；尼日菌素可以降低DU145细胞中β-catenin蛋白的表达，从而阻断Wnt信号的传导，抑制下游转录因子的活性、降低靶基因的表达水平。结论 尼日菌素可显著抑制前列腺癌细胞的侵袭与转移，可能与其抑制Wnt/β-catenin信号传导相关。

前列腺肿瘤；尼日菌素；前列腺癌细胞；Wnt/β-catenin信号传导；侵袭；转移

在世界范围内，前列腺癌发病率在男性所有恶性肿瘤中位居第二位［1］，严重威胁男性身体健康。我国前列腺癌的发病率虽然远低于欧美国家，但近年来呈现明显上升趋势，且增长比欧美等西方国家更为迅速。目前对前列腺癌进行规范化的手术、放化疗及内分泌治疗，使患者生存率得到了明显提高，但是很多晚期伴有转移的患者预后仍然很差。

Wnt/β-catenin信号广泛存在于生物体内，其介导的细胞反应与胚胎发育及肿瘤发生、发展密切相关［2］。Wnt信号的异常激活往往可以促进肿瘤的发展与转移［2］。近年来针对肿瘤的分子靶向治疗一直是研究的热点，寻找新一代分子靶向药物治疗前列腺癌越来越受到重视。

尼日菌素是一种一元酸抗生素，该抗生素是一种钾离子载体，近年来被证实可以通过抑制乳腺癌、结直肠癌等肿瘤细胞的上皮间质转化（EMT），而对这些肿瘤有显著的抑制作用［3］。Lu等［4］报道在HEK293细胞中，尼日菌素类似于盐霉素可以选择性抑制Wnt1信号传导。本实验研究尼日菌素抗前列腺癌的作用与及其对Wnt/β-catenin信号传导的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

前列腺癌细胞株（DU145）购自美国模式培养物集存库（ATCC，Manassas，VA）；RPMI 1640培养液、胎牛血清、转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；尼日菌素购自美国Sigma公司；主要抗体β-catenin、phospho-β-catenin、cyclin D1、c-myc购自美国SCT公司；TOPflash及FOPflash荧光素酶报告质粒购自美国Millipore公司；CCK-8试剂购自日本同仁化学研究所；Transwell（24孔）小室购自美国Corning公司。

1.2 细胞培养与药物处理

前列腺癌DU145细胞于37℃、5%CO2的细胞培养箱中进行培养。传代时用EDTA消化液消化细胞至大部分贴壁细胞脱落后终止消化，吹打离心后取适量细胞传入新的培养瓶。细胞培养液中加入尼日菌素（5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L）对细胞进行干预处理，用0.1%DMSO（终浓度）处理作对照。

1.3 细胞增殖与迁移、侵袭实验

将尼日菌素药物处理DU145 24 h后，向培养板（96孔）中加入10 μl CCK8溶液，将培养板在培养箱中孵育3 h，以酶标仪测定450 nm的吸光度。细胞迁移侵袭实验用Transwell小室进行。将等量单个悬浮细胞铺于小室内，内含无血清培养基，小室下方为含10%胎牛血清的培养基，12 h后终止实验，用棉签仔细除掉小室内面未侵袭的细胞，迁移过小室底面纤维膜的细胞用结晶紫染色，拍片，然后将染料洗脱，于分光光度计下读取560 nm的吸光度值，进行定量分析。采用Cell Biolabs公司的试剂盒进行细胞侵袭实验，大体步骤与Transwell小室相同，室底的纤维膜预先铺有一层细胞外基质，只有具有侵袭、浸润能力的细胞（可分泌基质降解酶类等）才可穿过小室，移动到下层。12 h终止实验，用结晶紫染色并拍片，或用细胞洗脱液直接将浸润穿透纤维膜的细胞洗脱后裂解，然后用含有CyQuant®GR的荧光染料染色，读取480 nm/520 nm处的吸光度值，进行定量分析。

1.4 细胞蛋白抽提、免疫印迹及免疫荧光检测试验

参照Gao等［5］的技术方法抽提细胞全蛋白，进行Western免疫印迹研究。参照Chen等［6］建立的标准方法进行免疫荧光检测试验。用奥林巴斯Zeiss AxioObserver Z1荧光显微镜（×40）观察免疫荧光，并用相应Axiovision软件拍摄荧光照片。

1.5 TOP/FOP-flash荧光报告试验

用Lipofectamine 2000转染试剂在DU145细胞中转染入200 μg荧光素酶报告质粒（含有野生型的TCF转录因子结合位点的TOPflash质粒，或含有突变的TCF转录因子结合位点的FOPflash质粒）以及2 μg含有海肾荧光素酶的对照载体pRL-TK。以荧光素酶双报告分析测定荧光素酶活性。

1.6 统计学方法

使用SPSS l7.0统计学软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（χ±s）表示，用T-test和Oneway Anova方差分析比较各组间的差异，P＜0.05为差异有统计学意义。用Graph Pad Prism 5.01软件绘制统计图表。

2 结果

2.1 尼日菌素抑制前列腺癌DU145细胞的增殖与迁移、侵袭

用不同浓度的尼日菌素对前列腺癌DU145细胞进行干预处理，随后用CCK-8试剂对细胞活力进行检测。如图1所示，与对照组（DMSO处理）相比，3种剂量（5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L）的尼日菌素均可以显著降低前列腺癌DU145细胞的活力（P均＜0.05），表明尼日菌素对DU145细胞有明显的细胞毒性作用。

实验测定了尼日菌素对前列腺癌DU145细胞迁移及侵袭能力的影响。如图2及图3所示。在经过24 h的药物处理后，尼日菌素处理组（10 μmol/L）出现迁移过小室底面纤维膜的细胞数较对照组明显减少；侵袭实验同样显示，尼日菌素处理组中浸润穿透铺有一层细胞外基质纤维膜的细胞数较对照组显著降低。表明尼日菌素可以有效降低前列腺癌DU145细胞的迁移及侵袭能力。

图1 尼日菌素抑制前列腺癌DU145细胞增殖活性的测定

图2 尼日菌素抑制前列腺癌DU145细胞的迁移、侵袭试验

图3 尼日菌素抑制前列腺癌DU145细胞的迁移及侵袭能力的定量分析

2.2 尼日菌素抑制前列腺癌DU145细胞中β-catenin蛋白的表达及其下游靶基因的表达

β-catenin是Wnt信号传导通路中的重要分子，其将Wnt信号传导入细胞核，激活TCF/LEF1转录因子，从而促进β-catenin下游与肿瘤发生、发展密切相关的癌基因的表达，如c-myc、cyclin D1等［7，8］。因此，β-catenin蛋白的表达升高特别是在细胞核内的聚集增多可以促进肿瘤的发展，包括侵袭、转移等。我们通过Western免疫印迹实验测定了尼日菌素对前列腺癌DU145细胞中β-catenin蛋白表达水平的影响。结果表明，尼日菌素可使DU145细胞中的β-catenin蛋白的表达水平明显下降（P＜0.05），且浓度越高其效果越明显（图4-A）。与此对应的β-catenin下游靶基因c-myc及cyclin D1的表达亦显著下降（P＜0.05）（图4-B）。表明尼日菌素可以抑制β-catenin及其下游靶基因在前列腺癌DU145细胞中的表达。免疫荧光技术测定进一步验证了尼日菌素可以显著降低β-catenin在细胞膜、细胞质以及细胞核中的表达（图5）。

2.3 尼日菌素阻止Wnt/β-catenin信号传导，抑制TCF/LEF转录因子的活性

Wnt信号经Wnt/β-catenin通路传导入细胞核，激活TCF/LEF转录因子，从而促进相关靶基因c-myc、cyclin D1等的表达［8］。为进一步验证尼日菌素对Wnt/β-catenin信号传导的抑制作用，我们进行了TOP/FOP-flash荧光素酶报告试验，检测TCF/LEF转录因子的转录活性。如图6所示，不同剂量的尼日菌素处理组TCF/LEF转录因子的活性较对照组均显著下降（P＜0.05）。进一步说明尼日菌素可以阻断Wnt/β-catenin信号通路的传导，从而抑制TCF/LEF转录因子的活性。

图4 Western免疫印迹法测定尼日菌素对DU145细胞中β-catenin蛋白表达及其下游靶基因表达的影响

3 讨论

近年来，尼日菌素被研究证实对乳腺癌、结肠癌等肿瘤细胞有显著的杀伤作用。它可以通过抑制EMT，诱导间质上皮性转化（MET）而降低肿瘤细胞的侵袭、迁移能力［3，9］。而目前尼日菌素对其他肿瘤的细胞毒性作用尚不明确，此外尼日菌素抗肿瘤的具体分子机制亦不十分清楚，这些都有待进一步深入研究。本研究证实，尼日菌素对前列腺癌DU145细胞有较强的杀伤作用，且显著抑制前列腺癌DU145细胞的迁移与侵袭。同时，我们进一步研究发现，尼日菌素可以显著降低DU145细胞中β-catenin蛋白的表达水平，从而阻断与肿瘤发生、发展密切相关的Wnt/β-catenin信号通路的传导。

尼日菌素是一种聚醚离子载体，可以促碱金属钾离子（K+）与氢离子（H+）的交换，从而破坏线粒体的膜电势，促进腺苷三磷酸酶（ATPase）的活性［10］。它主要是催化阳离子通过线粒体膜来发挥抗生素杀菌作用［11］。Zhou等［9］在结直肠癌细胞中研究发现，尼日菌素可以上调EMT过程中上皮性标志物E-cadherin的表达，并同时下调间充质性标志物Vimentin的表达，同时，尼日菌素可以显著降低结直肠癌干细胞标志物CD133阳性表达的比例，影响其部分干细胞特性，降低结直肠癌细胞株的自我更新能力和增殖能力。而Lu等［4］的研究表明，尼日菌素类似于与之化学结构相近的盐霉素，作为传统的钾离子载体，不仅可以对乳腺癌干细胞具有细胞毒性作用，还可以选择性抑制HERK293细胞中的Wnt1介导的信号传导。我们在研究前列腺癌DU145细胞中发现，尼日菌素的抗肿瘤作用与其抑制Wnt//β-catenin信号传导通路可能密切相关。

Wnt/β-catenin信号传导通路是生物进化过程中一个比较保守的信号通路，参与调控多种细胞生理、病理过程，包括细胞增殖、分化、运动、组织维持等，持续的Wnt/β-catenin信号激活可以导致过度的干细胞更新或增殖，从而容易诱发组织细胞癌变［12］。此外，肿瘤细胞中这一信号通路的激活可以诱导细胞EMT，使肿瘤细胞获得向周围浸润、侵袭的能力［12］。而作为该信号通路中的关键分子β-catenin，其在细胞核内的表达对Wnt信号的传递起着关键的作用。Wong等［13］研究发现，细胞核内β-catenin的表达与进展期结直肠癌的发生呈正相关。本研究表明，尼日菌素可以显著降低β-catenin蛋白的表达水平，抑制β-catenin进入细胞核传导Wnt信号，进而显著抑制Wnt信号下游靶基因的表达。Lu等［4］的研究提示，尼日菌素可以选择性抑制Wnt1介导的LPR6的磷酸化作用，从而导致脂蛋白受体相关蛋白6（lipoprotein receptor-related protein6，LPR6）蛋白的降解，从而阻滞Wnt信号传导通路。但是，Wnt/β-catenin信号传导通路错综复杂。本研究中尼日菌素是如何调控β-catenin的表达，是直接靶向该分子，还是通过其他途径调控其转录或磷酸化降解等等，都有待进一步深入研究。

综上，本研究表明尼日菌素可以有效抑制前列腺癌DU145细胞的增殖、迁移与侵袭，可能与其抑制β-catenin的表达、阻断Wnt信号传导相关。这为研究尼日菌素抗肿瘤的分子机制以及今后可能将其用于前列腺癌的临床治疗提供了良好的理论基础。

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［2014-10-15收稿］［2014-11-10修回］［编辑 阮萃才］

Effects of nigericin on Wnt/β-catenin signaling in DU145 prostate cancer cells

YOU Zhe-bin1，JIN Run-sen2（1First department of senior cadres of Fujian Provincial Hospital，Provincial Clinical Medical College of Fujian Medical University，Fuzhou 350001，P.R.China；2Department of Surgery，Ruijin Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200025，P.R.China）

JIN Run-sen.E-mail：jinrs_1985@eyou.com

Objective To evaluate the effect of nigericin on DU145 prostate cancer cells and explore its influence on Wnt/β-catenin signaling.Methods The human prostate cancer cell line DU145 was treated with 5，10 or 20 μmol/L nigericin or with DMSO as a control. Cultures were assessed for viability using the Cell Counting Kit-8，and for migration and invasion ability using transwell assays.The expression of β-catenin and its downstream target genes was analyzed using Western blotting，immunofluorescence and TOP/FOP-flash reporter assays.Results Nigericin showed significant toxicity towards DU145 cells and markedly inhibited their migratory and invasive abilities.The drug also reduced the expression of β-catenin，suppressing the Wnt/β-catenin pathway and down-regulating downstream target genes.Conclusion These findings suggest that nigericin significantly inhibits invasion and metastasis of DU145 prostate cancer cells in vitro，and that the drug likely exerts these effects by suppressing Wnt/β-catenin signaling.

Prostate neoplasm；Nigericin；Prostate cancer cell；Wnt/β-catenin signaling；Invasion；Migration

R737.25

A

1674-5671（2014）04-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.04.06

金润森。E-mail：jinrs_1985@eyou.com