蒲公英总黄酮在聚乙二醇-硫酸铵双水相体系中的分配与提取

杨利民，吕金萍，冯妍

（常州大学石油化工学院，江苏 常州 213164）

蒲公英总黄酮在聚乙二醇-硫酸铵双水相体系中的分配与提取

杨利民，吕金萍，冯妍

（常州大学石油化工学院，江苏 常州 213164）

蒲公英中内含的黄酮类物质具有较高药用价值，用双水相萃取法提取植物中有效成分是新型提取高附加值生物质的有效方法。本文考察了PEG/(NH4)2SO4双水相体系萃取分离蒲公英总黄酮时聚乙二醇相对分子质量、PEG质量分数、(NH4)2SO4质量分数、温度、pH值5个因素对分配行为的影响，并通过正交实验优化了工艺条件。结果表明最佳双水相提取工艺条件为:(NH4)2SO4质量分数18%，PEG1000质量分数23%，pH值5.34，提取温度25℃，NaCl盐的存在与否对萃取影响很小，蒲公英中总黄酮的提取率可达5.47%。因此，使用双水相法提取蒲公英总黄酮是该类提取技术中一种更加绿色环保和高效的方法。

蒲公英；总黄酮；双水相；分配；提取

蒲公英又名黄花地丁，属菊科多年生植物，是一种重要的中草药，主要成分为黄酮类物质，药用价值高。据报道黄酮类物质有很多的生物活性[1-3]，具有清热解毒、消痈散结、利尿、缓泻、退黄疸、利胆等功效[4]。

两种高聚物或高聚物与某种高价无机盐溶于水并静止一段时间后会形成不相容的上下两相，其中两相都含有大量的水分，这一两相体系称作双水相体系。这种现象由Beijerinck于1896年第一次发现，因两相对某些化学物质的溶解性的差异，双水相体系被广泛用作一种较为新型的萃取方法-双水相萃取，如双水相萃取被广泛用于生物化学和生物化工产品的分离纯化[5-6]。与传统的方法相比，双水相萃取技术具有操作条件温和、易于工业放大、成本低、过程连续化等优点。目前在中药提取领域，双水相萃取已经有效应用于黄芩苷[7]、葛根素[8]、黄酮类化合物[9-12]、绿原酸[13]等天然中药化合物的提取，但聚乙二醇（PEG）/(NH4)2SO4双水相体系在蒲公英总黄酮萃取中的应用还尚未见公开报道。本文主要研究了蒲公英总黄酮在PEG/(NH4)2SO4双水相体系中的分配行为，检测了PEG/(NH4)2SO4双水相体系的相图，考察了双水相组成、温度、pH值等因素对蒲公英总黄酮提取率的影响，从而可以优化双水相萃取蒲公英总黄酮的工艺条件。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

蒲公英全草（采于常州大学）用清水洗干净，于65℃鼓风干燥箱中干燥烘干12h，粉粹后过80目筛子；芦丁标准品，国药集团化学试剂有限公司；PEG，平均相对分子质量分别为400、1000、4000；95%乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠，均为市售分析纯。

721G可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；WT2102型分析天平，常州万得天平仪器有限公司；FW100型高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司；KQ-3200B超声波清洗器，巩义市于华仪器有限责任公司；PHS-3C pH计，上海盛磁仪器有限公司。

1.2 实验方法

准确称取一定量的蒲公英样品粉末，用石油醚浸泡1h，脱脂。然后倒出，挥发至干。加入一定量的60%乙醇微波加热，离心分离得粗提液。

以乙醇粗取液为原料，固定双水相体系总质量10g，在10mL的离心管中加入一定量的PEG和(NH4)2SO4，2mL粗提液，加水至10g，摇匀后2000r/min离心5min，静置分层。分别测定两相中总黄酮的含量。按照式（2）、式（3）计算黄酮在双水相体系中的分配系数K和萃取率Y。

式中，R为双水相体系上下相的体积比； Vt为双水相体系上相体积，mL；Vb为双水相体系下相体积，mL；K为双水相体系分配系数；Ct为双水相体系中上相黄酮的浓度，mg/mL；Cb为双水相体系中下相黄酮的浓度，mg/mL；Y为蒲公英黄酮在双水相中的萃取率，%。

1.3 蒲公英中总黄酮含量的测定

用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH体系分光光度法测定总黄酮含量[14]，以芦丁为标准品，溶液在400～700nm波长范围内全波长扫描，在波长507～510nm出现最大值，结合文献数据，选择用510nm波长测定标准曲线和蒲公英总黄酮的含量。黄酮类化合物浓度C与吸光度A的线性回归方程式为：y=11.59714x-0.0031，相关系数R2=0.9998。由标准曲线计算出总黄酮含量。蒲公英中总黄酮的提取率如式（4）。

式中，m为提取液中总黄酮的质量，g；M为加入的蒲公英样品粉末的总质量，g。

1.4 PEG/(NH4)2SO4双水相体系相图的制作

25℃下，根据Albertsson浊点法[15]，分别测定并制作由PEG400、PEGl000、PEG4000与(NH4)2SO4溶液形成的各体系相图。

准确称取2.0g 40%PEG400溶液于烧杯中，加入已知浓度的(NH4)2SO4溶液，振荡，滴至混合物体系刚好出现浑浊状态，记录加入的质量（g），然后加水至溶液澄清，记录加入水的质量（g）。算出此时PEG和(NH4)2SO4在系统中的质量分数，即得相图中的一个点。重复上述操，以硫酸铵质量分数为横坐标，PEG质量分数为纵坐标作图，即可得PEG/硫酸铵体系相图。

2 结果与讨论

2.1 双水相体系相图

测得的双水相相图如图1所示，曲线上的点为临界点，曲线下方为单相区，不分相；上方为两相区。

在两相区内，上相富含PEG，下相富含(NH4)2SO4，在(NH4)2SO4质量分数一定时，PEG相对分子质量越大，成相时所需的PEG的质量分数越小，越易形成双水相体系。但是PEG分子量越大，黏度越大，分相时间越长。当PEG质量分数一定时，(NH4)2SO4质量分数过低不能形成两相；过高会析出。因此，实验点应从曲线上方的区域选取，但PEG相对分子质量、质量分数以及(NH4)2SO4质量分数三者需相互协调。

图1 PEG/(NH4)2SO4双水相体系相图

2.2 双水相萃取的影响因素

2.2.1 PEG相对分子质量对萃取的影响

根据相图，选择质量分数均为20%的不同相对分子质量的PEG（400、1000、4000）和质量分数为20%的(NH4)2SO4分别组成双水相体系，研究蒲公英中总黄酮的分配系数K和萃取率Y的变化，结果见表1。表1中，随着PEG相对分子质量的增加，上下相体积比R逐渐减小，下相体积逐渐增大。分配系数K在PEG相对分子质量为400时较小，1000和4000时，相差不大。PEG相对分子质量对萃取率Y影响不明显。这与文献[10，16]结论一致。因为PEG相对分子质量越低，亲水性越好，成相时水分分配得越多，上下相体积比越大。随着PEG相对分子质量增加，虽然上相体积减少，但总黄酮浓度增加，分配系数增大，有利于后续总黄酮与上相的分离。综合来看，PEG1000萃取效果最好，所以后续试验都采用PEG1000进行相关研究。

2.2.2 PEG1000质量分数对双水相体系的影响

考察了PEG1000和(NH4)2SO4的质量分数对上下相体积、分配系数和萃取率影响。用3组不同的(NH4)2SO4质量分数在改变PEG质量分数的条件下，进行了一系列的实验。结果表明，(NH4)2SO4质量分数为18%时的萃取效果最好。依此为例加以说明（表2）。当PEG质量分数小于18%时，体系不能形成两相；PEG质量分数大于26%时，会有盐析出。随着PEG质量分数的增加，两相的体积比R逐渐增大，下相体积逐渐减小。这与文献[12]结论一致。因为PEG质量分数增加，夺取盐相中水分子的能力增强，上相体积增加，上相中PEG的浓度依然是增加的，这有利于蒲公英总黄酮更多分配到上相中，因此分配系数和萃取率都增大。考虑成本，选择PEG质量分数为24%。

2.2.3 (NH4)2SO4质量分数对双水相体系的影响

固定PEG质量分数在24%，考察(NH4)2SO4质量分数对蒲公英总黄酮的分配系数和萃取率的影响（表3）。可以看出，随着(NH4)2SO4质量分数的增加，两相体积比逐渐减小，下相体积逐渐增大。这与文献[17-18]结论一致。因为硫酸铵是强电解质，在水中离解为正、负离子，形成水合离子的能力增强，能夺取更多的水分子，所以下相体积增加，上下相体积比下降。表3中，随着(NH4)2SO4质量分数的增加，分配系数和萃取率先增加，到(NH4)2SO4质量分数为18%时达到最大，而后下降。原因是随着(NH4)2SO4质量分数的增加，上相中PEG含量和(NH4)2SO4都增加，上相中PEG含量增加有利于被萃取物的提取[19]，但(NH4)2SO4含量增加不利于这种提取。所以在(NH4)2SO4质量分数为18%时，分配系数和萃取率都达到各自的最大值。

2.2.4 pH值的影响

pH值不同，双水相体系中两相的电位差不同[19]，不仅影响上下两相的体积比，也影响各种待分离成分在上下相的分配。在选择PEG1000和(NH4)2SO4的质量分数分别为24%和18%的双水相体系，采用HCl和NaOH水溶液调节pH值，考察pH值对总黄酮在双水相体系中分配系数和萃取率的影响，结果如图2。由于(NH4)2SO4为强酸弱碱盐，显微酸性，碱性条件下易水解，释放出氨气，从而影响双水相体系的稳定，所以选择pH值在1～7范围内来考察体系pH值对蒲公英中总黄酮分配系数和萃取率的影响。从图2可以看出，随着体系pH值的增大，分配系数K和萃取率Y都是先增大后减小，pH值为3.74时，这一双水相体系的分配系数和萃取率较高。

表1 PEG相对分子质量对蒲公英总黄酮分配的影响

表2 PEG1000质量分数对蒲公英总黄酮分配的影响

2.2.5 温度的影响

温度对双水相体系的热力学平衡有显著的影响[20]，从而间接影响了蒲公英总黄酮在两相中的分配。PEG1000和(NH4)2SO4的质量分数分别为24%和18%且pH值在3.74的条件下，考察温度对双水相体系的影响，见图3。实验结果表明，随着温度的升高，虽然分相速度加快，但由于溶解度增加，上下相体积比R和萃取率都逐渐降低。大规模的双水相萃取操作一般在室温下进行，不仅能节省能源也能提高收率。

2.2.6 NaCl质量分数的影响

在25℃、PEG1000和(NH4)2SO4的质量分数分别为24%和18%、pH值为3.74的条件下，考察加入不同质量分数的NaCl盐对双水相体系萃取蒲公英中总黄酮的影响，见表4。

在双水相体系中加入NaCl，由于正、负离子在两相间的分配系数不同，在两相间形成电位差，从而影响带电大分子的分配。由表4可见，加入NaCl，两相体积比R、分配系数K和萃取率Y有小幅下降；当NaCl质量分数大于0.3%时盐不能完全溶解，或造成(NH4)2SO4析出。从成本和后续分离考虑，在实际生产过程中可以不加入NaCl。

表3 (NH4)2SO4质量分数对蒲公英总黄酮分配的影响

图2 pH值对分配系数和萃取率的影响

图3 温度对分配系数和萃取率的影响

表4 NaCl质量分数对蒲公英总黄酮分配的影响

2.3 正交试验设计和结果

在单因素实验的基础上，选取PEG1000质量分数（A）、(NH4)2SO4质量分数（B）、pH值（C）3个因素3个水平[L9(34)]进行正交试验（表5）。

正交试验结果见表6，从试验结果看出，各因素对蒲公英黄酮分配的影响顺序为(NH4)2SO4质量分数＞pH值＞PEG质量分数，最优的条件是PEG1000质量分数23%、(NH4)2SO4质量分数18%、pH值5.34，分配系数达到最大88.32。与单因素实验结果基本一致。

表5 L9(34)正交试验水平和因素设计

2.4 不同方法的比较结果

取上述正交试验最优条件下的双水相体系30g，加入0.50g蒲公英粉末，在微波条件下考察蒲公英总黄酮的提取率。采用微波辅助主要是为缩短双水相直接采取的时间。实验结果与乙醇水浴加热回流法、微波辅助萃取法、超声波辅助萃取法等3种方法进行了比较，见表7。3种方法中的实验条件分别如下：乙醇水浴加热回流法，60%乙醇、料液比1∶60、加热1h；微波辅助萃取法，乙醇浓度60%、料液比1∶60、微波功率350W、微波时间55s；超声波辅助萃取法，乙醇浓度60%、料液比1∶60、超声时间30min。

与乙醇水浴加热回流法相比，微波辅助时最优条件下的双水相体系的蒲公英总黄酮提取率提高了15.36%；与微波法和超声法相比，分别提高了4.02%和7.68%。乙醇水浴加热回流法因长时间且高温的加热使得黄酮类物质分解，不利于总黄酮的提取。微波辅助和超声萃取法，缩短了萃取时间，也一定程度上提高了总黄酮的提取率。而双水相体系的提取率是最高的，而且溶剂无毒、用量减少，节省了成本。另外，极性强的亲水性物质更多的进入富含硫酸铵的下相，使得上相蒲公英总黄酮的纯度进一步提高。

表6 正交试验设计与结果

表7 双水相萃取法与其它方法的比较

3 结 论

考察了蒲公英黄酮在PEG1000/(NH4)2SO4双水相体系中的分配规律，通过正交试验优化，最佳萃取双水相体系的PEG相对分子质量是1000，PEG1000的质量分数为23%，(NH4)2SO4质量分数为18%，萃取温度在25℃、体系pH值为5.34。用这种双水相体系，在微波辅助下直接萃取蒲公英中的总黄酮，提取率可达5.47%。与其他传统方法相比，双水相萃取法的提取率有了明显的提高。所以，双水相法萃取蒲公英总黄酮是一种更加绿色环保、又易于工业化的高效方法。

[1] Cao J G，Xia X，Chen X F，et al. Characterization of flavonoids from Dryopteris erythrosora and evaluation of their antioxidant，anticancer and acetylcholinesterase inhibition activities[J].Food and Chemical Toxicology，2013，51：242-250.

[2] 陈景耀，吴国荣，王习达，等. 蒲公英黄酮类物质的抗氧化活性[J]. 南京师范大学报：自然科学版，2005，28（1）：84-87.

[3] Orhan D D，Ozcelik B，Ozgen S，et al. Antibacterial，antifungal，and antiviral activities of some flavonoids[J].Microbiol. Res.，2010，165：496-504.

[4] Williams C A，Goldstone F，Greenham J. Flavonoids，cinnamic acids and coumarins from the different tissues and medicinal preparations of taraxacum officinale[J].Phytochemistry，1996，42（1）：121-127.

[5] 欧阳平凯. 生物分离技术[M]. 北京：化学工业出版社，1999.

[6] Walter H，Brooks D E，Fisher D. Partitioning in aqueous two-phase systems[M]. New York：Academic Press，1985.

[7] 赵爱丽，陈晓青，蒋新宇. 应用双水相萃取法分离黄芩苷的研究[J]. 中成药，2008，30（4）：498-501.

[8] Bi P Y，Dong H R，Yuan Y C. Application of aqueous two-phase flotation in the separation and concentration of puerarin from puerariae extract[J].Separation and Purification Technology，2010，75（3）：402-406.

[9] Ma F Y，Gu C B，Li C Y，et al. Microwave-assisted aqueous two-phase extraction of isoflavonoids from Dalbergia odorifera T. Chen leaves[J]，Separation and Purification Technology，2013，115：136-144.

[10] 赵晓莉，岳红，张颖，等. 柿叶黄酮在双水相体系中的分配行为[J].林产化学与工业，2006，26（1）：183-186.

[11] 张春秀，胡小玲，卢锦花，等. 银杏叶黄酮类化合物的提取分离Ⅰ. 银杏黄酮化合物的提取[J]. 化学研究与应用，2001，13（4）：454-456.

[12] 石慧，陈媛梅. PEG/(NH4)2SO4双水相体系在加杨叶总黄酮萃取分离中的应用[J]. 现代生物医学进展，2008，8（5）：854-857.

[13] Martin T M，Yu Y，Cui Z Q，et al. Optimization and orthogonal design of an ultra-sonic-assisted aqueous extraction process for extracting chlorogenic acid from dry tobacco leaves[J].Chinese Journal of Natural Medicines，2012，10（4）：311-320.

[14] 魏永生，王永宁，石玉平，等. 分光光度法测定总黄酮含量的实验条件研究[J]. 青海大学学报：自然科学版，2003，21（3）：61-63.

[15] Alberttson P A. Partition of Cell Particles and Macromolecules[M]. New York：Wiley Publishing，1971：58-71.

[16] 杨基础，沈忠耀，汪家鼎. 用聚乙二醇-磷酸盐双水相体系从枯草杆菌发酵液中提取α-淀粉酶[J]. 清华大学学报：自然科学版，1987，27（3）：81-89.

[17] 张春秀，胡小玲，卢锦花，等. 双水相萃取法富集分离银杏叶浸取液的探讨[J]. 化学研究与应用，2011，13（6）：686-688.

[18] 巩育军，姚晓青，薛鹏升. 聚乙二醇-硫酸铵双水相萃取结晶紫的研究[J]. 化学与生物工程，2011，28（1）：27-29.

[19] 王艳，彭奇均. PEG/(NH4)2SO4双水相萃取分离茶氨酸的研究[J].应用化工，2011，40（7）：1086-1191，1208.

[20] De Lemos L R，Patricio P D R，Rodrigues G D. Liquid-liquid equilibrium of aqueous two-phase systems composed of poly(ethylene oxide) 1500 and different electrolytes (NH4)2SO4，ZnSO4and K2HPO4：Experimental and correlation[J].Fluid Phase Equilibria，2011，305：19-24.

Partition and extraction of total flavonoids from Taraxacum mongolicum in PEG/(NH4)2SO4aqueous two-phase system

YANG Limin，LÜ Jinping，FENG Yan
（School of Petrochemical Technology，Changzhou University，Changzhou 213164，Jiangsu，China）

Total flavonoids inTaraxacum mongolicumare a highly effective medicine，and aqueous two-phase extraction process is an effective technique for extracting biomaterials from plant. Effect of molecular weight and mass fraction of PEG，mass fraction of (NH4)2SO4，temperature and pH of aqueous two-phase system were investigated during extraction of total flavonoids fromTaraxacum mongolicum.The optimal extraction conditions were obtained through orthogonal experiments. The optimal condition thus obtained is as follows:the average molecular weight of PEG at 1000，the mass fraction of PEG1000 at 23%，the mass fraction of (NH4)2SO4at 18%，temperature at 25℃，pH at 5.34. The NaCl addition has little effect on flavonoids partition. The extraction yield of total flavonoids fromTaraxacum mongolicumcan reach up to 5.47% under this optimal condition. Compared with other extraction methods，the aqueous two-phase extraction process is a more environment-friendly and highly efficient technique.

Taraxacum mongolicum；total flavonoids；aqueous two-phase system；partition；extraction

TQ 028.8

A

1000-6613（2014）08-1992-06

10.3969/j.issn.1000-6613.2014.08.009

2013-12-18；修改稿日期：2014-01-16。

及联系人：杨利民（1962—），男，副教授，博士，研究方向为多相反应与分离。E-mail lyang@jpu.edu.cn。