MTT法检测氧化石墨烯的细胞毒性

关淑英+武峰+赵彬

[摘要] 目的 研究丝素-氧化石墨烯复合膜（SF-GO）的细胞毒性。 方法 采用MTT比色法检测含有不同浓度氧化石墨烯（0.1 wt%、0.2 wt%、0.5 wt%、1.0 wt%）制成的丝素-氧化石墨烯复合膜在不同时期（1 d、3 d、5 d、7 d）对小鼠成纤维细胞L929 细胞相对增殖率（RGR）的影响；通过透射电镜观察各组细胞的形态，最终评价丝素-氧化石墨烯复合膜的细胞毒性。 结果 随着氧化石墨烯浓度的增加，细胞毒性在不断增加（P﹤0.01）；随着测定天数的增加，氧化石墨烯的细胞毒性虽减小，但无统计学意义，且各组总体趋势均在减小；通过透射电镜照片可见各组细胞形态基本正常，细胞生长良好，为长梭形或卵圆形， 并可见圆形分裂细胞， 细胞折光性强。结论 氧化石墨烯浓度≤1wt%时无明显细胞毒性。

[关键词] 氧化石墨烯；细胞毒性；MTT法

[中图分类号] R318.08 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）17-0018-03

MTT assay for cetection of the cytotoxicity of graphene oxide

GUAN Shuying WU Feng ZHAO Bin

Shanxi Medical University， Taiyuan 030001，China

[Abstract] Objective To study the cytotoxicity of silk fibroin-graphene oxide composite film（SF-GO）. Methods MTT assay was applied to test the impact of silk fibroin-graphene oxide composite film containing different graphene oxide concentrations（0.1 wt%， 0.2 wt%， 0.5 wt%， 1.0 wt%） at different periods（1d， 3d， 5d， 7d） on the relative growth rate （RGR） of rat fibroblast L929， and transmission electron microscope was applied to observe cell shape in different groups. The cytotoxicity of silk fibroin-graphene oxide composite film was evaluated. Results The cytotoxicity kept increasing with increase of graphene oxide concentration（P<0.01）. With days passing by， the cytotoxicity of graphene oxide gradually decreased without statistical significance， but the overall trend of decreased cytotoxicity was observed in all groups. Transmission electron microscope demonstrated that all groups had normal cell shape and good cell growth with spindle or oval shapes. Circular splinter cells were observed with strong cellular refractivity. Conclusion There is no obvious cytotoxicity with graphene oxide concentration≤1 wt%.

[Key words] Graphene oxide； Cytotoxicity； MTT assay

牙列缺损或牙列缺失是口腔修复中最常见的疾病，目前治疗牙列缺损、缺失的最佳方法为种植修复，但种植体植入后需要等待骨愈合的时间较长，期间会影响患者的咀嚼、说话功能，因而许多患者不愿意进行种植修复，从而影响了种植修复技术在临床中的应用。因此如何缩短种植骨植入后的愈合期成为当前种植领域的一大热点。辛伐他汀（simvastatin）是3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，近年来研究指出：辛伐他汀不仅能够有效降低胆固醇和低密度脂蛋白[1]，还可能促进松质骨的骨量增加，减少骨折发生[2]。然而，他汀类药物主要作用部位是肝细胞，在其他组织中的分布浓度非常低， 要使他汀类药物对骨组织发挥有效作用则需要对骨组织局部用药，需要加入一种缓释剂使辛伐他汀小量而连续缓慢定量释放，以达到促进骨形成的效果。近年来，石墨烯衍生物成为纳米生物医学领域研究的热点[3，4]。氧化石墨烯为石墨烯衍生物。大量研究表明，氧化石墨烯没有明显的细胞毒性，且分散性能好，是一种性能优良的药物载体，并且是一种良好的药物缓释剂。丝素蛋白是蚕丝的主体，研究表明[5]它具有良好的生物相容性、无毒、无污染、无刺激性、可生物降解，常被用于细胞培养的基质和组织工程。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小鼠成纤维细胞 （L-929，中科院上海细胞资源中心）；四甲基偶氮唑盐（M TT，Sigma，美国）；新生小牛血清 （杭州四季青有限公司）；丝素蛋白（SF，美国）；氧化石墨烯（GO，美国）；PBS缓释液（自配）；二甲基亚砜（Sigma，美国）；0.25% 胰酶（Hyclone，美国）； JEOLJEM-1200EX透射电镜（日本电子）；CARY100紫外可见吸收光谱仪（瓦里安，美国）；DNM-9602酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司）； 倒置相差显微镜（OLYMPUS）；超净台、 CQ50 超声波清洗器等。

1.2方法与步骤

1.2.1 PBS溶液的配制NaCl 8 g， KCl 0.2 g， Na2HPO4 1.56 g， KH2PO4 0.2 g， 加蒸馏水1000 mL。

1.2.2 MTT试剂的配制 将粉状 MTT 以 5 g/L的浓度溶于配制的100 mL PBS 溶液， 抽滤灭菌。

1.2.3丝素-氧化石墨烯复合膜（SF-GO）的制备 先将氧化石墨烯在真空干燥箱中干燥24 h，称取一定量的氧化石墨烯分散在二次水中，超声1 h，得到氧化石墨烯分散液，分别取出一定量的分散液加入到5个锥形瓶中，加二次水至10 mL，加入50 μL的冰醋酸，称取100 mg丝素蛋白5份，加入锥形瓶中，搅拌混合，将混合液倒入6孔板中，超声15 min脱气泡，50℃烘干48 h，得到氧化石墨烯添加量为0 wt%、0.1 wt%、0.2 wt%、0.5 wt%、1.0 wt%丝素-氧化石墨烯复合膜。

1.2.4 测定材料的细胞相对增殖率 将制作好的不同浓度的丝素-氧化石墨烯复合膜剪成直径为1 cm的小圆片，放入24孔板，各4孔，共接种4块板，每个孔分别加入1 mL的PBS液，将0 wt%浓度组设为对照组，15 min后将所有孔中PBS液吸出。将浓度为2.5×107个细胞/L的小鼠成纤维细胞 L929细胞悬液接种于放有不同浓度丝素-氧化石墨烯复合膜（SF-GO）的24孔培养板，每孔 1 mL，然后置于37℃、5% CO2培养箱中开放培养 1、3、5、7 d后分别吸去培养液，倒置显微镜下观察细胞形态，再加入5 g/L的 MTT液 0.1 mL， 继续在37℃培养4 h，吸弃原培养液， 每孔加入2 mL PBS小心清洗 2 次； 弃除余液， 立即在各孔中加入二甲基亚砜1 mL， 室温放置并轻微振荡20 min使结晶物充分溶解； 然后用酶联免疫检测仪测定其吸光度值（A），取平均值（波长为490 nm），并将吸光度值（A1）转换成胞相对增值率（RGR），然后将各组的RGR转换成细胞毒性级别。细胞毒性试验[6]采用5分制法进行细胞毒性分级。RGR（%） = 实验组平均OD值×100%/对照组平均OD值。细胞相对增殖率与细胞毒性的分级的关系：RGR（%）≥100%细胞毒性为0级；RGR（%）为75%～99%，细胞毒性为1级；RGR（%）为50%～74%，细胞毒性为2级；RGR（%）为25%～49%，细胞毒性为3级；RGR（%）为1%～24%，细胞毒性为4级；RGR（%）为0%时，细胞毒性为5级。0级和1级被认为没有细胞毒性，2级为轻度细胞毒性，3级和4级为中度细胞毒性，5级为明显细胞毒性。

1.3 统计学处理

实验中OD值用均数±标准差表示，增值率用百分数表示，通过SPSS17.0 软件包进行统计学处理，相应的各组间比较采用LSD-t检验，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1细胞毒性评价

2.1.1细胞形态观察 透射电镜照片可见各组细胞形态正常，细胞生长良好，为长梭形或卵圆形， 并可见圆形分裂细胞， 细胞折光性强，表明氧化石墨烯浓度≤1wt%时无明显细胞毒性，见图1。

图1 各组培养1 d后细胞形态（×500）

2.1.2 各组细胞OD值、细胞增殖率及细胞毒性 见表1。由表1可以看出，随着氧化石墨烯浓度的增加细胞增殖率在不断降低，细胞毒性在增加，各组差异有统计学意义（P﹤0.05）。随着测量天数的增加，细胞增殖率在不断增加，细胞毒性在减小，各组差异无统计学意义（P>0.05）。氧化石墨烯浓度为0.1 wt%组在第7天，细胞增长非但未受抑制，反而增长。

3 讨论

2004年，英国Manchester大学Geim等通过努力成功制备了世界上最薄的新型二维纳米材料-石墨烯 [7]，其厚度仅为0.35 nm[8]。石墨烯具备较好的电学、力学和热学等性能[9]，使其在众多领域具有重要的应用前景[10]，成为近年来纳米领域研究的热点。但在生物医学领域其衍生物氧化石墨烯应用较多，它是用石墨经氧化、超声制备而来。近年来研究表明，氧化石墨烯没有明显的细胞毒性且分散性能好，可以作为一种性能优良的药物载体，并且是一种良好的药物缓释剂。

该实验采用MTT比色法也叫四甲基偶氮唑蓝比色法[11]，其基本原理为MTT的环可以被存在于活细胞中位于细胞色素b和细胞色素c位点的细胞线粒体琥珀酸脱氢酶裂解，从而将淡黄色的MTT催化还原为蓝色难溶性的结晶物沉积在细胞内，通过结晶物颜色的深浅反映结晶物的多少，从而反映细胞的多少及细胞新陈代谢活性的强弱。该比色法操作简便、灵敏度高且可以定量评价，目前被广泛应用于体外细胞毒性的评价。本实验通过比较小鼠成纤维细胞L929 细胞在氧化石墨烯浓度为0.1 wt%、0.2 wt%、0.5 wt%、1.0 wt%的丝素-氧化石墨烯复合膜在不同时间段的增殖率来评价氧化石墨烯的细胞毒性。结果显示，细胞毒性与氧化石墨烯的浓度呈正相关，因丝素本身不具有细胞毒性，所以细胞毒性来自氧化石墨烯且具有浓度依赖性；随着测量天数的增加，细胞毒性在减小，虽各组在1、3、5、7 d差异无统计学意义，但各组细胞毒性总体趋势在减小，其原因为随着时间的延长，氧化石墨烯的释放量在减少。通过表1可知，除氧化石墨烯浓度为1.0 wt%时在1、3 d细胞毒性为2外，其余各组细胞毒性为0、1，表明浓度为0.1 wt%、0.2 wt%、0.5 wt%的氧化石墨烯无细胞毒性，而且氧化石墨烯浓度为0.1wt%组在第7天，细胞增长非但未受抑制，反而增长。浓度为1.0 wt%的氧化石墨烯有轻度细胞毒性。通过电镜图片可以发现各组细胞形态基本正常，细胞生长良好，遮光性强，说明细胞毒性小。石墨烯产生细胞毒性的机制：①石墨烯特殊结构导致其在细胞膜上的聚集、沉积表现出一定的毒性。②细胞毒性作用还包括受caspase 3介导的细胞凋亡机制。③细胞毒性作用还来自氧化应激机制即自由基损伤。目前作为药物载体，氧化石墨烯的应用主要集中在小分子药物输运方面[12]，有可能进一步推广到基因和蛋白药物的输运、治疗方面，在其他方面的工作还比较少，有待于更进一步的研究。

综上所述，低浓度的氧化石墨烯无明显细胞毒性，因此，氧化石墨烯可以用于口腔修复的治疗中。

[参考文献]

[1] 宋文植，尹万忠，杨欢，等. MTT法检测纳米金粒子体外细胞毒性的研究[J]. 中国实验诊断学，2011，15（8）：1242-1245.

[2] Mundy G，Garret R，Harris S，et al. Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins[J]. Science，1999， 28（6）：1946-1949.

[3] Delahoy PJ，Magliano DJ，Webb K，et al. The relationship between reduction in low-density lipoprotein cholesterol by statins and reduction in risk of cardiovascular outcomes：an updated meta-analysis[J]. Clin Ther，2009，31（8）：236-244.

[4] Mohantyn，Berry V.Graphene.based single.bacterium Resolution biode-viee and DNA transistor：interfacing grapheme derivatives with nanoBcaleand miemscale biocomponents[J]. Nano Lett，2008，12（8）：4469-4476.

[5] Shancs，Yanghf，Songjf，et al. Directelectro-chemistry of glucose oxidase and biosensing for glucose based on graphene[J]. Anal Chem，2009，8（1）：2378-2382.

[6] Sun X，Liu Z，Welsherk，et al. Nano-graphene oxide for cellular imagirig and drug delivery[J]. Nano Res，2008，13（1）：203-212.

[7] Peng C， Hu WB， Zhou YT. Intracellular imaging with a grapheme-based fluorescent probe[J]. Small， 2010， 21（6）： 1686-1692.

[8] Novoselovks， Geimak，Morozovsv，et al. Electric field effect in atomicallythin carbon films[J]. Science，2004，30（6）：666-669.

[9] Leecg，Weixd，Kysarjw，et al. Measurement of the elastic properties and intrinsic strength of monolayergrapheme[J].Science，2008，3（21）：385-388.

[10] Lin FS， Cheng CT， Liu WC， et al. Chemical auxiliary-free Polymerization yielding non-linear PEG for protein-resistant application[J]. Rsc Advances，2012，2（18）： 7174-7179.

[11] 刘琼，王娟，陈秀华. Fe3O4 纳米粒子-氧化石墨烯纳米复合物的制备、表征及体外毒性评价[J]. 中国医药工业杂志，2013，44（3）：253-257.

[12] Shao Q， Wu P， Xu X Q， et al. Insight into the effects of graphene oxide sheets on the conformation and activity of glucose oxidase： towards developing a nanomaterial-based protein conformation assay[J]. Phys Chem Chem Phys，2012，14（25）： 9076-9085.

（收稿日期：2014-04-08）

综上所述，低浓度的氧化石墨烯无明显细胞毒性，因此，氧化石墨烯可以用于口腔修复的治疗中。

[参考文献]

[1] 宋文植，尹万忠，杨欢，等. MTT法检测纳米金粒子体外细胞毒性的研究[J]. 中国实验诊断学，2011，15（8）：1242-1245.

[2] Mundy G，Garret R，Harris S，et al. Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins[J]. Science，1999， 28（6）：1946-1949.

[3] Delahoy PJ，Magliano DJ，Webb K，et al. The relationship between reduction in low-density lipoprotein cholesterol by statins and reduction in risk of cardiovascular outcomes：an updated meta-analysis[J]. Clin Ther，2009，31（8）：236-244.

[4] Mohantyn，Berry V.Graphene.based single.bacterium Resolution biode-viee and DNA transistor：interfacing grapheme derivatives with nanoBcaleand miemscale biocomponents[J]. Nano Lett，2008，12（8）：4469-4476.

[5] Shancs，Yanghf，Songjf，et al. Directelectro-chemistry of glucose oxidase and biosensing for glucose based on graphene[J]. Anal Chem，2009，8（1）：2378-2382.

[6] Sun X，Liu Z，Welsherk，et al. Nano-graphene oxide for cellular imagirig and drug delivery[J]. Nano Res，2008，13（1）：203-212.

[7] Peng C， Hu WB， Zhou YT. Intracellular imaging with a grapheme-based fluorescent probe[J]. Small， 2010， 21（6）： 1686-1692.

[8] Novoselovks， Geimak，Morozovsv，et al. Electric field effect in atomicallythin carbon films[J]. Science，2004，30（6）：666-669.

[9] Leecg，Weixd，Kysarjw，et al. Measurement of the elastic properties and intrinsic strength of monolayergrapheme[J].Science，2008，3（21）：385-388.

[10] Lin FS， Cheng CT， Liu WC， et al. Chemical auxiliary-free Polymerization yielding non-linear PEG for protein-resistant application[J]. Rsc Advances，2012，2（18）： 7174-7179.

[11] 刘琼，王娟，陈秀华. Fe3O4 纳米粒子-氧化石墨烯纳米复合物的制备、表征及体外毒性评价[J]. 中国医药工业杂志，2013，44（3）：253-257.

[12] Shao Q， Wu P， Xu X Q， et al. Insight into the effects of graphene oxide sheets on the conformation and activity of glucose oxidase： towards developing a nanomaterial-based protein conformation assay[J]. Phys Chem Chem Phys，2012，14（25）： 9076-9085.

（收稿日期：2014-04-08）

综上所述，低浓度的氧化石墨烯无明显细胞毒性，因此，氧化石墨烯可以用于口腔修复的治疗中。

[参考文献]

[1] 宋文植，尹万忠，杨欢，等. MTT法检测纳米金粒子体外细胞毒性的研究[J]. 中国实验诊断学，2011，15（8）：1242-1245.

[2] Mundy G，Garret R，Harris S，et al. Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins[J]. Science，1999， 28（6）：1946-1949.

[3] Delahoy PJ，Magliano DJ，Webb K，et al. The relationship between reduction in low-density lipoprotein cholesterol by statins and reduction in risk of cardiovascular outcomes：an updated meta-analysis[J]. Clin Ther，2009，31（8）：236-244.

[4] Mohantyn，Berry V.Graphene.based single.bacterium Resolution biode-viee and DNA transistor：interfacing grapheme derivatives with nanoBcaleand miemscale biocomponents[J]. Nano Lett，2008，12（8）：4469-4476.

[5] Shancs，Yanghf，Songjf，et al. Directelectro-chemistry of glucose oxidase and biosensing for glucose based on graphene[J]. Anal Chem，2009，8（1）：2378-2382.

[6] Sun X，Liu Z，Welsherk，et al. Nano-graphene oxide for cellular imagirig and drug delivery[J]. Nano Res，2008，13（1）：203-212.

[7] Peng C， Hu WB， Zhou YT. Intracellular imaging with a grapheme-based fluorescent probe[J]. Small， 2010， 21（6）： 1686-1692.

[8] Novoselovks， Geimak，Morozovsv，et al. Electric field effect in atomicallythin carbon films[J]. Science，2004，30（6）：666-669.

[9] Leecg，Weixd，Kysarjw，et al. Measurement of the elastic properties and intrinsic strength of monolayergrapheme[J].Science，2008，3（21）：385-388.

[10] Lin FS， Cheng CT， Liu WC， et al. Chemical auxiliary-free Polymerization yielding non-linear PEG for protein-resistant application[J]. Rsc Advances，2012，2（18）： 7174-7179.

[11] 刘琼，王娟，陈秀华. Fe3O4 纳米粒子-氧化石墨烯纳米复合物的制备、表征及体外毒性评价[J]. 中国医药工业杂志，2013，44（3）：253-257.

[12] Shao Q， Wu P， Xu X Q， et al. Insight into the effects of graphene oxide sheets on the conformation and activity of glucose oxidase： towards developing a nanomaterial-based protein conformation assay[J]. Phys Chem Chem Phys，2012，14（25）： 9076-9085.

（收稿日期：2014-04-08）