西妥昔单抗-β葡萄糖苷酶偶联物的制备及鉴定

刘云龙 周 洁 王光文 聂 振

细胞与分子生物学

西妥昔单抗-β葡萄糖苷酶偶联物的制备及鉴定

刘云龙 周 洁△王光文 聂 振

目的 制备西妥昔单抗-β葡萄糖苷酶偶联物并鉴定其酶活性与抗体活性。方法采用4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)将西妥昔单抗、β-葡萄糖苷酶进行共价交联。采用非还原型聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、比色法、间接免疫荧光法对偶联物进行鉴定并检测β-葡萄糖苷酶、西妥昔单抗的活性。结果在电泳图上可分别见到β葡萄糖苷酶、西妥昔单抗、西妥昔单抗-β葡萄糖苷酶偶联物的清晰条带。比色法测定结果显示，西妥昔单抗-β-葡萄糖苷酶偶联物的酶活性低于β-葡萄糖苷酶(U/L：672.97±46.19 vs 869.50±57.28，t=5.972，P＜0.05)，但仍保持良好的酶活性。在荧光显微镜下可见到与偶联物共同作用的人膀胱癌EJ细胞带有红色荧光。结论Sulfo-SMCC可成功将西妥昔单抗、β-葡萄糖苷酶偶联，且偶联物仍能保持良好的酶活性与抗体活性。

西妥昔单抗；β-葡萄糖苷酶；偶联物；膀胱肿瘤；癌；Sulfo-SMCC

化疗是目前治疗肿瘤的主要方法之一，提高化疗药物的治疗效果，降低其不良反应一直是研究热点。抗体介导的酶前体药物疗法(antibody directed enzyme prodrug therapy,ADEPT）是先将酶导向靶部位，再给予无抗癌活性或低活性的前体药物，在酶的催化下将其转化为细胞毒性药物，从而实现抗癌药物在靶部位特异性释放的一种方法，该疗法不仅提高了药物对肿瘤细胞的杀伤效率，而且很大程度上降低了化疗药物引起的不良反应[1-2]。β-葡萄糖苷酶/苦杏仁苷酶解前药疗法是使用较多的ADEPT之一，苦杏仁苷本身毒性很低，经β-葡萄糖苷酶激活后可以产生氢氰酸（HCN），抑制细胞呼吸，导致细胞死亡[3]。西妥昔单抗是一种新型的人-鼠单克隆嵌合抗表皮生长因子受体（EGFR）抗体，其能够将酶导向靶部位，实现药物的特异性靶向杀伤作用，在EGFR阳性的恶性肿瘤中能发挥出色的抗肿瘤活性，显著增强放疗和化疗的效果，目前主要应用于结直肠癌和头颈部鳞癌的治疗，在膀胱癌方面的应用还比较少[4]。本研究通过化学偶联的方法制备西妥昔单抗-β葡萄糖苷酶偶联物并鉴定其酶活性与抗体活性，以期为进一步研究其对膀胱癌的疗效奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 西妥昔单抗购自德国Merck公司；4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)、Traut’s试剂购自美国Thermo Fisher公司；纯化脱盐柱购自美国Thermo公司；Amicon Ultra-15超滤离心管购自美国Millipore公司；人膀胱癌EJ细胞株购自南京凯基细胞公司；罗丹明标记羊抗人IgG购自北京博奥森生物技术有限公司；β-葡萄糖苷酶、对硝基苯基-β-D吡喃葡萄糖苷（PNPG）购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 西妥昔单抗-β-葡萄糖苷酶偶联物的制备 取4 mg西妥昔单抗，采用含2 mmol/L EDTA的PBS（pH 8.0）稀释其至2 g/L，然后加入Traut’s试剂74 μg，室温摇床反应1 h，纯化脱盐、超滤除去过量的巯基化试剂及其他反应杂质，浓缩后即得到巯基化的西妥昔单抗1 mL。称取β-葡萄糖苷酶9.2 mg，用1 mL PBS(pH 7.5，0.01 mol/L)溶解，加入10 mmol/L的异型双功能偶联剂衍生物Sulfo-SMCC溶液220 μL，室温摇床反应1 h，采用同上方法除去过量的Sulfo-SMCC及杂质，浓缩活化β-葡萄糖苷酶至4 mL。将上述制备的西妥昔单抗加入到活化好的β-葡萄糖苷酶溶液中，室温搅拌反应2 h，超滤除去过量的β-葡萄糖苷酶及其他反应杂质，浓缩后即得到西妥昔单抗-β-葡萄糖苷酶偶联物。

1.2.2 西妥昔单抗-β-葡萄糖苷酶偶联物的鉴定 （1）非还原型聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定偶联物。分别取适量西妥昔单抗、β-葡萄糖苷酶溶液、西妥昔单抗-β-葡萄糖苷酶偶联物使用上样缓冲液进行适当稀释，进行7％非还原型SDS-PAGE，以鉴定西妥昔单抗-β-葡萄糖苷酶偶联物的连接情况。（2）比色法鉴定西妥昔单抗-β-葡萄糖苷酶偶联物酶活性。将β-葡萄糖苷酶溶液、西妥昔单抗-β-葡萄糖苷酶偶联物分别用PBS调整为相同的浓度0.5 g/L，以β-葡萄糖苷酶溶液作为对照测定偶联物的酶活性。取2支10 mL离心管分别加入4.9 mL底物液[用柠檬酸磷酸盐缓冲液（pH 6.0，0.1 mol/L）将对硝基苯基-β-D吡喃葡萄糖苷配成终浓度为5 mmol/L底物液]和0.1 mL β-葡萄糖苷酶、西妥昔单抗-β-葡萄糖苷酶偶联物，37℃水浴反应，5 min、15 min时分别取出0.5 mL反应液，加入1 mL碳酸盐缓冲液（0.2 mol/L）终止反应。从各管终止液反应体系中取200 μL加入96孔板，设3个复孔，根据底物水解后释放出来的对硝基苯酚在405 nm处的特征吸收峰，在酶标仪下测定每孔吸光度（A405）值。参照文献[5]计算酶活性（U/L）。（3）间接免疫荧光法检测西妥昔单抗-β-葡萄糖苷酶偶联物。取对数生长期人膀胱癌EJ细胞接种于6孔板(1×106个/mL)，培养至贴壁，用PBS洗涤2遍，加入200 μL 2％BSA 37℃封闭60 min，PBS洗涤2遍，选择其中3孔加入适当稀释后的西妥昔单抗-β-葡萄糖苷酶偶联物100 μL，剩余3孔加入PBS 100 μL作为阴性对照，4℃静置60 min。PBS洗涤2遍，分别加入50 μL罗丹明标记羊抗人IgG，4℃静置30 min，PBS洗涤3遍后，置于荧光显微镜下观察。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0软件包进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 西妥昔单抗-β-葡萄糖苷酶偶联物的SDSPAGE结果 在1、2泳道可见到与β-葡萄糖苷酶、西妥昔单抗相对应位置的条带；3泳道高分子质量端可见到清晰的条带，而在西妥昔单抗、β-葡萄糖苷酶相对应的位置未见条带，表明西妥昔单抗与β-葡萄糖苷酶偶联成功，见图1。

Fig.1 Cetuximab-β-glucosidase conjugate 7％non-reduced SDSPAGE results图1 西妥昔单抗-β-葡萄糖苷酶偶联物7％非还原型SDSPAGE结果

2.2 西妥昔单抗-β-葡萄糖苷酶偶联物的酶活性测定结果 与相同浓度的β-葡萄糖苷酶相比，西妥昔单抗-β-葡萄糖苷酶偶联物酶活性有所下降(U/L：672.97±46.19 vs 869.50±57.28，t=5.972，P＜0.05)。

2.3 间接免疫荧光检测结果 与西妥昔单抗-β-葡萄糖苷酶偶联物共同作用的人膀胱癌EJ细胞在荧光显微镜下可见到红色荧光，而对照组无荧光，见图2。

3 讨论

随着对蛋白交联技术的研究，人们发展了一系列异型双功能交联试剂用于蛋白质间的交联，其中马来酰亚胺基类活泼酯是应用较为普遍的一种，包括（N-马来酰亚胺基甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯（SMCC）、N-羟基琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫)-丙酸酯(SPDP)等。SMCC是对抗体进行酶标记的理想试剂，可较好地保持酶和抗体的活性，其交联原理是首先将含有氨基的蛋白质与几倍剂量的偶联剂反应，反应结束后通过脱盐、超滤等方法除去没有反应完的SMCC，再与含有巯基的蛋白质反应[6]。在探索抗体与酶偶联的过程中，笔者首先采用了本课题组使用的偶联剂SPDP，其偶联原理较SMCC复杂，蛋白质之间会产生一部分自身交联产物，且其纯化过程繁琐，导致偶联物产量低、纯度低等不足[7]。采用SMCC进行偶联只需两步反应，在经过脱盐、超滤后即可得到纯度高的偶联产物，同时偶联物保持了良好的活性。因此，SMCC是对抗体进行酶标记的理想试剂。而SMCC难溶于水，在进行蛋白修饰前必须先将SMCC溶于有机溶剂如DMSO或DMF中，为避免加入有机溶剂对蛋白活性造成的影响，本实验采用了其磺化后的衍生物Sulfo-SMCC。

应用Sulfo-SMCC偶联后，本研究通过非还原型SDS-PAGE对产物进行了初步鉴定，在3泳道高分子质量端可见到清晰的条带，而在西妥昔单抗、β-葡萄糖苷酶相对应的位置未见条带。用比色法测定后发现偶联物中β-葡萄糖苷酶的酶活性低于同等浓度β-葡萄糖苷酶活性。间接免疫荧光法测定结果示西妥昔单抗、β-葡萄糖苷酶在偶联后抗体活性仍然存在。表明西妥昔单抗-β葡萄糖苷酶偶联物已成功制备，为进一步研究其抗肿瘤效应奠定了实验基础。

西妥昔单抗可与EGFR的内源性配体竞争性地与EGFR胞外配体结合区相结合，阻断EGFR二聚体的形成，从而抑制癌细胞的增殖和肿瘤生长[8]。 Bhuvaneswari等[9]将西妥昔单抗与光动力疗法（PDT）联合应用于膀胱肿瘤异种移植模型，发现与单独PDT相比，联合应用能够显著地抑制肿瘤的生长。EGFR是一种跨膜糖蛋白，在膀胱癌、头颈部鳞癌、以及前列腺癌中有过量表达，为肿瘤治疗提供了一个理想靶点[10]。此外，在膀胱癌靶向治疗研究中，EGFR通路在细胞增殖、凋亡、分化、迁移和血管生成中也起到关键作用[11]。

Fig.2 Immunofluorescence images of cetuximab-β-glucosidase coupling product(×400)图2 西妥昔单抗-β葡萄糖苷酶偶联产物的免疫荧光检测结果（×400）

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（2014-07-07收稿 2014-08-12修回）

（本文编辑 闫娟）

Preparation and Identification of Cetuximab-β-Glucosidase Conjugates

LIU Yunlong,ZHOU Jie△,WANG Guangwen,NIE Zhen
Department of Urology,the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China△

E-mail：zhoujieuser@163.com

ObjectiveTo prepare cetuximab-β-glucosidase conjugates and to identify its enzymatic activity and antibody activity.MethodsCetuximab and β-glucosidase were crosslinked by Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate(Sulfo-SMCC).Cetuximab-β-glucosidase conjugates and its enzymatic and antibody activity were examined by non-reduced SDS-PAGE,colorimetry and indirect immunofluorescence assay.ResultsWe can see clear bands of β-glucosidase,cetuximab,cetuximab-β-glucosidase conjugates through electropherogram.Although the enzymatic activity of cetuximab-β-glucosidase conjugates was lower than that of β-glucosidase(U/L：672.97±46.19 vs 869.50± 57.28，t=5.972，P＜0.05)shown by colorimetry assay,it still maintain good enzymatic activity.Under fluorescence microscope,we can see the conjugates interacted with human bladder cancer EJ cells are in a red fluorescence.ConclusionCetuximab,β-glucosidase were crosslinked successfully by Sulfo-SMCC without altered its enzymatic and antibody activity.

cetuximab;β-glucosidase;conjugates;urinary bladder neoplasms;carcinoma;Sulfo-SMCC

R737.1，R73-36

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.12.001

国家自然科学基金资助项目（81160314）

广西医科大学第一附属医院泌尿外科（邮编530021）

△通讯作者 E-mail：zhoujieuser@163.com