西沙野生诺尼内生细菌群落多样性初步研究

曹艳花, 刘 洋,*, 姚 粟, 李金霞, 谭望桥, 程 池,*

(1.中国食品发酵工业研究院中国工业微生物菌种保藏管理中心,北京 100015;2.海南诺尼生物工程开发有限公司,海南海口 570125)

海滨木巴戟(Morinda citrifolia Linn.)属被子植物门(Angiospermae)木兰纲(Magnoliopsida)茜草目(Rubiales)巴戟天族(Trib.Morindeae)木巴戟组(Morinda Sect.Roioc)植物,生长于热带、亚热带,常被称为诺尼(Noni),也被称为海巴戟、檄树、椿根、桔叶巴戟天、诺丽果、诺尼、水冬瓜、檄书.原产于波利尼西亚、澳大利亚及一些太平洋岛屿,诺尼果被当地人称作“神奇果”,现引种于我国海南等地.诺尼这种植物,特别是它的果实,已经作为民间的医药被应用了几个世纪[1],可用来治疗多种疾病,如糖尿病、高血压、心脏不适、疼痛、精神压抑及消化不良等[2-3].已有科学研究证实诺尼果汁可以延长Lewis肺癌小鼠的寿命[4].Wong[5]通过医学记录和病理切片对2例癌症患者进行了回顾性分析,发现患者服用诺尼果汁一段时间后,症状明显改善.研究认为诺尼果汁在临床上虽不能作为主要抗癌药物,但可作为癌症免疫治疗的佐药.

诺尼果的抑菌功能是最先被发现的性质.早在1956年Atkinson就发现诺尼能够抑制某些微生物,如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、幽门螺旋菌等的生长,同时指出抑制微生物生长主要成分是酚类物质[6].Dittmar研究表明,诺尼果能够有效地抑制不同种属沙门氏菌、志贺氏菌生长.其研究同时也指出诺尼果抑菌作用在很大程度上与成熟度和处理过程有关,果实完全成熟并且不经过干燥处理时抑菌效果最好[7].诺尼果抑菌活性是否同其自身内生微生物也有一定关系尚无相关科学研究,还有待于科学的考证.目前对诺尼的研究主要集中在营养价值和药用价值研究,对诺尼内生微生物研究除本研究室外国内外尚无相关报道.内生菌是影响植物生长至关重要的因素,因此系统地研究诺尼果内生菌具有重要意义.

本研究首次采用16S rDNA克隆文库构建非培养方法对西沙野生诺尼果内生细菌进行群落多样性初步分析,可以获得西沙野生诺尼果内生细菌菌群结构及其分布,能够更好地为开发利用诺尼这种特色经济物种奠定理论基础.同时首次采用Mothur软件对诺尼果内生细菌克隆文库数据进行分析,构建Mothur软件数据分析平台,为进一步的研究奠定理论基础.

1 材料与方法

1.1 西沙诺尼果样品的采集

本研究以海南西沙野生诺尼成熟果实为研究材料.于2012年12月采集自中国海南省三沙市永兴岛,具体位置为东经112.34°,北纬16.83°.样品采用无菌袋密封置于冰上冷藏,带回实验室后于-80℃低温保藏备用.

1.2 培养基及试剂

LB培养基:10 g胰蛋白胨,5 g酵母提取物,10 g NaCl,pH 7.0,去离子水定容至1 000 mL.LB固体培养基中需另加15 g琼脂.

细菌基因组DNA提取及PCR相关试剂均购自TIANGEN公司;PCR引物合成及序列测定由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成.

1.3 诺尼果表面灭菌

采用乙醇-次氯酸钠联合灭菌[8]的方式对野生诺尼果进行表面灭菌,首先将野生诺尼果用无菌水彻底清洗干净表面,然后依次用体积分数为70%的乙醇浸泡3 min,质量分数为2.6%的次氯酸钠溶液浸泡5 min,体积分数为70%的乙醇清洗30 s,最后用无菌水冲洗5次,无菌滤纸吸取多余水分.将最后一次清洗的水少量涂布于R2A检测平板上作为对照用于表面灭菌的效果检测,要求对照平板无菌落生长,确保表面灭菌彻底.

1.4 野生诺尼果基因组DNA的提取和纯化

采用改良的CTAB方法直接从已表面灭菌彻底的野生诺尼果中提取和纯化基因组DNA.称取10 g已表面灭菌的野生诺尼果置于研钵中,用液氮充分研磨后放入带有已灭菌处理的EP管中,参考Liu等[9]对玉米种子内生细菌总DNA提取的方法进行诺尼果内生细菌基因组DNA提取.所得样品基因组DNA于-20℃保存.基因组DNA的检测在1.0%琼脂糖凝胶中电泳,EB染色后采用凝胶成像系统成像.

1.5 野生诺尼果内生细菌16S rDNA的PCR扩增及PCR产物纯化

采用细菌 16S rDNA通用引物 799F(5′-AACAGGATTAGATACCCTG-3′)和 1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)对野生诺尼果基因组总DNA的16S rDNA部分片段进行PCR扩增[10].反应体系(50uL):10×buffer 5 uL 、dNTP(2.5 mmol/L)4 uL、引物799F(10 mmol/L)2 uL、引物1492R(10 mmol/L)2 uL、Taq 酶(5 U/uL)0.25 uL、DNA 模板 3 uL,并采用ddH2O补足至50 uL.PCR反应程序:94℃5 min;94℃1 min,55℃1 min,72℃1 min,30个循环;72℃10 min.扩增产物采用2.0%的琼脂糖凝胶电泳,将所需条带与其他植物DNA分开,EB染色后观察扩增结果,在紫外灯下用干净的刀片切下730 bp左右DNA条带的琼脂糖凝胶,放入无菌的1.5 mL离心管中.采用OMEGA试剂盒纯化回收PCR产物,严格按照说明书操作.

1.6 野生诺尼果内生细菌16S rDNA克隆文库构建

使用DU 800核酸蛋白分析仪测定纯化后16S rDNA的PCR产物浓度.根据载体说明书将已经纯化后约为730 bp的PCR产物与pEASY-T3载体(TRANSGEN)进行连接转化.采用蓝白筛方法进行阳性克隆的筛选.文库挑取100个白色克隆采用T7和SP6引物进行PCR阳性克隆检测,并将阳性克隆菌液送样北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序.序列采用Chimera-Check程序检测并剔除嵌合序列,非嵌合序列采用EzBioCloud(http:∥eztaxone.ezbiocloud.net/)进行序列比对分析,确定与已知模式菌株序列同源性关系.

1.7 克隆文库的分析

采用 Mothur软件[11](http://www.mothur.org/)对构建的克隆文库进行Rarefaction curve绘制和多样性指数比较分析.

1.7.1 绘制Rarefaction curve

利用Mothur软件可以直接计算出可操作分类单元(OTU)及相应的n值.Rarefaction curve根据16S rDNA克隆文库中已知OTU的相对比例,获得n个克隆时出现OTU数量的期望值,然后根据n值与其对应的OTU数量的期望值来制作曲线,当Rarefaction curve趋于平缓或者已经达到平台期时就能够表示克隆文库的库容已经基本足够.

1.7.2 多样性指数比较分析

利用Mothur软件计算chao丰富度指数、ACE丰富度指数、Shannon-Weaver多样性指数和Simpson优势度指数[12],对诺尼果内生细菌丰富度及多样性等进行评价.

1.8 16S rDNA基因系统发育分析

将获得的诺尼果内生细菌阳性克隆进行测序,并将测定结果中代表序列提交至GenBank.用ClustalX 1.83按照最大同源性的原则对测定序列及其模式菌株序列进行比对,并用MEGA 4.0软件以邻接法(neighbor-jining method)构建系统发育树[13],自展值(Bootstrap values)设为1 000分析评估进化树的稳定性,进行系统发育分析.

2 结果与分析

2.1 野生诺尼果基因组DNA的提取

野生诺尼果表面灭菌最后一次清洗用水涂布于R2A检测平板48h后未见菌落生长,证明野生诺尼果样品表面灭菌彻底.以表面灭菌合格的野生诺尼果为材料,采用改良的CTAB法提取基因组DNA,利用DU800核酸蛋白分析仪测定DNA浓度,260nm/280nm大小约为1.8,符合标准.琼脂糖凝胶结果显示,基因组DNA片段大小约为23kb,见图1,其中包含诺尼果和内生细菌两者的基因组DNA.

2.2 野生诺尼果内生细菌16S rDNA片段PCR扩增

细菌DNA与植物线粒体DNA和叶绿体DNA在系统发育分析上具有较近同源性,对于植物基因组DNA的PCR过程其引物的选择是关键.参考孙磊等[10]利用基因组DNA为模板进行水稻根内生细菌16S rDNA片段PCR扩增方法,本研究为尽量避免植物线粒体DNA和叶绿体DNA干扰,利用799f-1492r引物对诺尼果基因组DNA进行PCR扩增.扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳方法检测为两条带,一条位于730 bp左右,应为野生诺尼果内生细菌16S rDNA片段,另一条位于1 000～1 500 bp,应是诺尼果线粒体DNA片段,结果如图2.

利用OMEGA胶纯化回收试剂盒对凝胶电泳检测中位于730 bp胶回收纯化,回收730 bp的PCR产物,见图3,将用于构建野生诺尼果内生细菌16S rDNA克隆文库.

图1 基因组DNAFig.1 Genomic DNA

图2 PCR扩增Fig.2 PCR amplification

图3 PCR扩增产物的纯化Fig.3 Purification of PCR products

2.3 野生诺尼果内生细菌16S rDNA克隆文库构建及序列分析

利用TRANSGEN公司的pEASY-T3克隆试剂盒将已纯化回收730 bp左右PCR产物进行连接、转化,构建野生诺尼果内生细菌16S rDNA克隆文库.挑取了100个16S rDNA白色克隆子,送样测序后经chimera-check分析检测嵌合序列并剔除.西沙野生诺尼果16S rDNA克隆文库共获得93条可用序列.将16S rDNA克隆序列利用EzBioCloud比对分析,与GeneBank数据库序列进行相似性比较从而得到最相近的模式菌株序列.

将所得到的16S rDNA序列比对结果中代表序列提交GeneBank数据库,所得序列号为KC478826-KC478837.得到西沙野生诺尼果内生细菌序列比对结果如表1.在属水平上构建系统发育树,如图4.构建的西沙诺尼果内生细菌16 S rDNA克隆文库中,93个克隆分属于12个不同的可操作分类单元(OTU),序列比对结果表明,大部分克隆与已知细菌的16S rDNA序列相似性较高.93个克隆分别属于变形菌门(Proteobacteria)的 Alpha、Beta、Gamma纲,放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)中的不动杆菌属(Acinetobacter sp.)、水杆状菌属(Aquabacterium sp.)、甲基杆菌属(Methylobacterium sp.)、水库杆菌属(Piscinibacter sp.)、玫瑰单胞菌属(Roseomonas sp.)、赛托氏菌属(Schlegelella sp.)、厌氧球菌属(Anaerococcus sp.)、嗜蛋白胨菌属(Peptoniphilus sp.)、链球菌属(Streptococcus sp.)、放线链孢菌属(Actinomycetospora sp.)和土壤红色杆形菌属(Solirubrobacter sp.).从表中可以看出,优势菌群为变形菌门(Proteobacteria),优势属为β变形菌纲(β-Proteobacteria)中的(Piscinibacter sp.),占总克隆数的80.65%,为绝对优势菌群.

表1 非培养方法分离诺尼果内生细菌16S rDNA序列相似性分析Tab.1 Sequence analysis of 16S rDNA from fruit of Noni

2.4 Rarefaction curve对克隆文库的评价

通过Mothur软件比较DNA序列相似性,将相似性大于或等于97%的序列归为同一种可操作分类单元(OTU).采用Mothur软件生成的数据绘制稀缺性曲线(Rarefaction curve)如图5,Rarefaction curve图显示OTU数目随克隆子数目增多而增加,但增幅逐渐变小,稀缺性曲线上升幅度逐渐平缓,这在一定程度上表明挑取的克隆已基本能反应诺尼果内生细菌克隆文库中优势细菌的类群.

2.5 诺尼果内生细菌多样性比较分析

研究用Mothur软件计算诺尼果内生细菌16S rDNA序列的遗传矩阵,再进行OTU分类,用chao和ACE对物种丰富度进行估算,并计算Shannon多样性指数和Simpson优势度指数.97%遗传距离的多样性如表2,结果表明在97%遗传距离的水平诺尼果内生细菌chao丰富度指数为10.75,ACE丰富度指数为11.8,Shannon Weaver多样性指数为0.899,Simpson优势度指数为0.651 4.目前利用Mothur软件对克隆文库数据进行分析的相关报道较少,袁超磊等[14]在红壤剖面微生物群落研究中,所得不同样品chao的范围在23-2219.本研究chao指数同其比较相对较低,这同样品采集及样品为内生细菌的研究有较大关系,在一定程度上能够反映西沙野生诺尼果内生细菌群落具有一定的丰富度,后续研究中还需进一步对多个样品比较分析.许璐等[15]研究中国沙棘居群的多样性,多样性指数平均值为0.85.本研究的Shannon多样性数值为0.899同其相比略高,能够表明诺尼果内生细菌较为丰富.

图4 邻接法构建的诺尼果内生细菌16S rDNA序列系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree constructed with endophytic bacteria isolated from fruit of Noni

表2 OTU分类及细菌多样性比较分析Tab.2 OTU list and comparative analysis of bacterial diversity

图5 诺尼果内生细菌16S rDNA克隆文库稀缺性曲线Fig.5 Rarefaction curve of endophytic bacterial 16S rDNA clone library of fruit of Noni

3 讨 论

诺尼是天然、富含多种营养成分的植物,具有很高的临床药用价值.目前诺尼在我国海南等热带地区的引种种植已获成功,在海南诺尼生物工程开发有限公司诺尼种植基地已较大面积的推广种植.同时国内外的研究均表明,诺尼植株本身和诺尼产品对于当今的城市病、亚健康等都有着很好的疗效.其保健产品的开发和研究已成为新的热点,已投放市场的保健产品有诺尼果汁、冻干粉等,市场前景较好.我国新制定的《食品工业“十二五”发展规划》中,营养与保健食品制造业首次被纳入国家食品产业规划并成为重点行业,这反映了国家对保健食品产业发展的高度重视.然而目前对重要的保健食品原材—诺尼的研究主要集中在种植、栽培、产品研发等的研究,对诺尼果内生菌的相关研究尚无相关报道.本研究采用构建克隆文库的非培养方法首次对诺尼果内生细菌群落多样性进行初步分析,不仅具有重要的理论与创新意义,而且具有重要的实施必要性.

本研究首次采用构建16S rDNA克隆文库的方法对我国海南西沙诺尼果内生细菌群落结构多样性进行初步分析,16S rDNA系统发育分析表明获得的93个诺尼果内生细菌克隆归属于变形菌门(Proteobacteria),放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)三大类群,水库杆菌属(Piscinibacter sp.)为优势菌群,研究结果揭示出诺尼果内生细菌群落结构具有较为丰富的多样性,为诺尼内生菌的相关研究提供理论依据.水库杆菌属(Piscinibacter sp.)目前此属中只有水水库杆菌(Piscinibacter aquaticus)一个种.Piscinibacter aquaticus是2009年由Methylibium aquaticum分类学地位变迁而来,最初人工分离自淡水池塘.已有研究表明水水库杆菌(Piscinibacter aquaticus)在R2A培养基上培养4天菌落圆形、米色、表面光滑,菌体短杆状,具有碱性磷酸酶活性,能分泌植物生长素吲哚乙酸[16].刘洋等[17]已有研究表明在西沙野生诺尼种子内生细菌群落中包含6.11%的水库杆菌属(Piscinibacter sp.).本研究中水库杆菌属(Piscinibacter sp.)占80.65%,而其他植物内生细菌的报道中尚未见如此高比例.对诺尼果中的水库杆菌属(Piscinibacter sp.)还需通过可培养方法获得纯菌种后进行深入研究.因本研究对野生诺尼果内生细菌群落结构进行初步研究,在本研究获得的理论基础上还需对多个样品进行宏基因组等方法分析,以期获得野生诺尼果内生细菌群落结构较为详细的信息.

本研究首次采用Mothur软件对诺尼内生细菌克隆文库进行多样性分析,构建数据分析平台,为进一步的科学研究奠定基础.在对非培养方法获得的序列进行可操作分类单元(OTU)划分时,分类的标准是非常重要的因素也是比较有争议的指标.常用的OTU物种定义标准是99%[18]的序列相似性(遗传距离分界值设定为0.01)和97%[19]的序列相似性(遗传距离分界值设定为0.03).本研究以“属”水平为标准采用97%的序列相似性,同时为有效地避免单一指数评价造成的偏差,通过多种指数来综合评价物种的多样性.这也是本研究采用多样性指数、丰富度指数和优势度指数等多种指数进行分析的原因所在,这样得出的结论才更具有客观性.本研究通过多样性指数的分析显示研究结果能够在一定程度上表明西沙野生诺尼果内生细菌具有多样性.

综上所述,西沙野生诺尼果中内生细菌群落多样性较为丰富.在此研究基础上,将进一步开展诺尼果可培养内生微生物及功能微生物的研究,并对微生物的组成与诺尼果汁理化性状的相关性进行研究,为诺尼微生态系统相关研究提供更丰富的信息.

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