金黄色葡萄球菌快速检测技术的研究进展

高 路, 何聪芬,*, 李 萌, 张昕悦

(1.北京工商大学北京市植物资源研究开发重点实验室,北京 100048;2.河北联合大学生命科学学院,河北唐山 063000)

金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)是食品、医院内感染以及化妆品领域重要的致病菌之一[1].金黄色葡萄球菌肠毒素现已成为世界性卫生问题,根据美国疾病预防控制中心报告,在美国整个细菌性食物中毒中由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的为33%,加拿大更多,为45%,其他一些欧洲国家如芬兰、匈牙利等占50%以上.我国每年由于金黄色葡萄球菌引起的中毒事件也非常多[2].由于抗生素的大量使用,促进了耐药性菌株的不断出现,尤其是耐甲氧西林菌,其中就包括了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA).因此建立MRSA的检测方法,对控制MRSA的感染是十分重要的.

1 传统检测方法

传统方法[1,3]检测金黄色葡萄球菌主要通过富集培养、分离纯化培养、菌落的形态观察和一系列的生化鉴定以及血清型鉴定等步骤进行检测,检测过程需时大概4～7 d,步骤烦琐.临床上MRSA的检测最常采用的是传统的药物敏感试验方法,其中包括药敏纸片法、β-内酰胺酶检测、苯唑西林盐琼脂筛查法、E-test和试管双倍稀释法等.但是MRSA的检出很容易受到培养基成分,特别是氯化钠含量、pH值、孵育时间、接种量、温度以及培养基中是否加诱导剂等多种因素影响,方法比较费时,并且使用方法不当时,容易造成漏检或误检.

2 快速检测方法

近几年来,金黄色葡萄球菌的快速检测及其自动化研究进展迅速.目前,国内外针对金黄色葡萄球菌检测方法分为生化检测、免疫学检测以及分子生物学检测3个方面.

2.1 生化检测

2.1.1 显色培养基

1974年,Alain研发了用于检测大肠杆菌的显色培养基并于1979年申请专利,成立了法国科玛嘉公司.显色培养基的原理是利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色来检测微生物的新型培养基.显色培养基是将目标微生物特征酶加入到选择培养基中,将微生物的特征性酶的测试和选择性培养同时进行.当目标微生物在培养基上选择性的生长,其特征酶能够降解显色底物,并产生带有特殊颜色的代谢产物,使得菌落呈现特定的颜色.与此同时干扰菌被抑制或者不产生特征酶而不显色,通过显色培养基上菌落颜色形态观察或简单试验就可以进行鉴别.目前市场上比较成熟的金葡菌显色培养基产品主要有CHROM agar Staph aureus(生产商:科玛嘉公司),BBL CHROM agar Staph aureus(生产商:BD公司),S.aureus ID、3M Petrifilm Staph Express Countplate(生产商:生物梅利埃公司)等.

2.1.2 快速测试片

快速测试片是以纸膜、纸片、胶片等作为培养基的载体,将特定的显色物质和培养基附着在上面,通过微生物在上面的生长、显色来检测食品中微生物的一种快速检测方法.

金黄色葡萄球菌的快速测试片既具有显色培养基的灵敏、特异和高选择性,并且具有纸片法的方便、经济与快捷的特点,特别适合于食品中金黄色葡萄球菌的快速初筛,可以满足金黄色葡萄球菌快速检测的需要.

2.2 免疫学方法

免疫分析方法是利用抗体与抗原特异性结合的特性实现样品检测的方法.此法具有较高的特异性和灵敏度,可有效避免复杂样本中杂质干扰,简化了前处理净化步骤.用于食品安全检测的方法主要包括免疫凝聚和沉淀法、放射免疫法、酶联免疫法等.

2.2.1 乳胶凝集法

1980年,Essers和 Radebold首先使用乳胶凝集的方法准确检测金黄色葡萄球菌,此方法是基于特异性检测凝固酶活性(凝集因子)和蛋白A.过去的30年中,基于这一原理已经研制出许多商业化检测金黄色葡萄球菌的乳胶凝集试剂盒.Griethuysen等[4]对892株金黄色葡萄球菌样品采用乳胶凝集试剂盒进行检测,结果显示此方法的灵敏度和特异性分别为98.2%和98.9%,证实了乳胶凝集试剂盒能够有效地检测金黄色葡萄球菌,但在一些MRSA菌株凝集检测易出现假阴性.为了解决这一问题,研究人员开发了第三代金黄色葡萄球菌乳胶凝集检测试剂盒,此试剂盒在原有的基础上同时还检测5型和8型荚膜多糖.近年来,为了进一步提高特异性,第四代乳胶凝集试剂盒Staph Plus Latex Kit(Dia-MondiaL[DML],See,France)问世.第四代乳胶凝集试剂盒是将开发的蓝色羧基微粒与检测凝固酶、蛋白A以及5型和8型荚膜多糖相结合.在灵敏度和特异性方面第四代乳胶凝集试剂盒能够与第三代相媲美,且更易于鉴别金黄色葡萄球菌.

2.2.2 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)是近年来应用较为广泛的免疫学方法,其原理是将酶分子与抗体(抗原)分子相结合形成酶标记分子,这种酶标分子既具有免疫活性,又保留酶的活性.酶标记分子与固相免疫吸附剂中相应的抗原(抗体)或抗原抗体结合物相遇,形成了酶抗原抗体结合物,催化加入的底物产生有色产物,可根据颜色反应的深浅进行检测.它主要包括直接法、间接法、夹心法.ELISA法应用于检测金黄色葡萄球菌肠毒素,国内外有较多相关报道.随着抗各型肠毒素单克隆抗体的成功制备,ELISA诊断试剂盒也已开始得到广泛使用.

目前,美国食品和药品管理局认可使用的金黄色葡萄球菌检测ELISA方法主要有:TECRA(生产商:Bio enterprises Roseville,Australia),SET-EIA(生产商:Toxin Technology Madison,WI和Transia Lyon,France).

2.2.3 化学发光酶联免疫检测法

1977年,Halman等创建化学发光酶联免疫法(chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA).CLEIA法是将化学发光法和免疫分析法相结合,其原理是根据化学发光的强度(RLU)与反应物(产物)的浓度呈正比来进行检测.该方法既具有化学发光的高灵敏度,同时还具有免疫分析方法的高特异性,检测的线性范围宽,且简单快速,无放射性污染.Creton等[5]实验表明此方法的检测灵敏度常高于放射免疫分析,该方法已经广泛应用于食品卫生检测、临床标本检测.

刘飞[6]使用常规方法制备了20株针对SEB分子的单克隆抗体,并从中筛选出两株效价高、特异性强,识别不同表位组的两株单克隆抗体,组成抗体配对,通过微孔板式化学发光酶联免疫法对金黄色葡萄球菌肠毒素B进行检测.结果显示:此方法的检测限达到0.01 ng/mL,具有高特异性、高灵敏度、操作简单等优点.

2.3 分子生物学方法

聚合酶链式反应是1985年由Mullis等发明,采用DNA聚合酶进行体外酶促合成、扩增特定DNA片断的一种方法.该技术具有特异性强、灵敏度高、快速准确、高效等特点,因此在医学、生命科学、农业科学、环境科学、考古学等许多领域得到了广泛的应用.

2.3.1 多重PCR技术

随着聚合酶链式反应技术的发展,多重PCR法在检测金黄色葡萄球菌中得到了应用.其基本原理是同一反应体系中,同时加入多对引物,与此同时对多个特异性目的基因片段同时进行扩增,可以达到对多种细菌进行同步检测的目的,也可对多种类型的目的基因进行分型研究.Francois等[7]采用免疫磁珠法收集金黄色葡萄球菌,利用针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因的特异性引物和针对金黄色葡萄球菌femA基因引物,同时用两对引物对待测菌进行PCR扩增.此方法大大提高了鉴定MRSA的准确性.当mecA和femA基因表达均为阳性时,可确定为MRSA.因此可与mecA基因阳性的其他葡萄球菌属进行区分,此方法可同时鉴定MRSA、金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性的葡萄球菌.郑华妮等[8]根据金黄色葡萄球菌多种肠毒素基因的通用保守序列以及特异性序列,在3～4 h内检测出毒素基因A-E,检测的效果良好,建立了金黄色葡萄球菌肠毒素A-E的多重PCR检测法.

2.3.2 实时荧光定量PCR

实时荧光PCR检测技术(real-time fluorescent PCR)是在常规PCR中引入液相杂交技术和荧光探针,在PCR每一个循环扩增产物的过程中,实时检测收集相对应的荧光信号,从而实现样品(如病原菌)的定性或定量检测.因为只需检测出荧光强度的即时变化就可测出样品基因的拷贝数,具有快速、高特异性和高灵敏度,目前应用比较广泛.

苏明权等[9]以金黄色葡萄球菌特异性femB基因序列设计引物和探针,并利用基因重组技术构建了定量检测标准品,建立了实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌的方法,将模拟标本与分离培养进行了对比,两者符合率为100%.表明所建立的方法具有较好的特异性、灵敏度、稳定性和重复性.

2.3.3 环介导等温扩增技术

2000年,日本科学家Notomi建立了一种新型的核酸扩增技术,即环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP).其基本原理是针对靶基因的6个区域,设计4条特异性引物,恒温条件,在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)作用下几十分钟就可扩增出109～1010靶序列拷贝.核酸大量合成时,大量的焦磷酸根离子从dNTP中释放,与反应体系中Mg2+形成了丰富的副产物焦磷酸镁沉淀,可被肉眼观察.与此同时,也可以通过在体系中直接添加环引物(loop)来加快反应的速率[10].LAMP技术具有高特异性、高灵敏性、简便快速和成本低等特点.此技术已在动物疫病的诊断、动物胚胎的性别鉴定和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用.

2.3.4 基因芯片检测

生物芯片技术是20世纪90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一,是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉性新技术,是基础研究最有效的工具.利用基因芯片技术于临床微生物鉴定方面,将大大提高菌株的阳性检出率,缩短检验时间,具有现实的临床意义.1996年,世界上第一块商业化DNA芯片的问世,标志着基因芯片技术进入广泛研究和应用的阶段,此技术具有传统检测方法无法比拟的优越性.

2.4 金黄色葡萄球菌各种检测技术的比较

本文对各种金黄色葡萄球菌检测技术在优缺点以及应用领域等方面进行了比较,结果如表1.

2.5 金黄色葡萄球菌检测常用的特异性基因

本文将常用的金黄色葡萄球菌检测特异性基因进行了总结,结果如表2.

3 总结与展望

金黄色葡萄球菌致病性和侵袭力强,其耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株已成为主要致病菌.传统的检测金黄色葡萄球菌的方法费时耗力,已经难以满足社会的需求.金黄色葡萄球菌检测技术将向着更快速、更简易、更准确的方向发展.显色培养基具有灵敏、特异、简便等优点,虽存在假阳性与假阴性菌株的干扰,但与其他方法联用时可提高检测准确率;快速测试片法既具备了显色培养基的优点,又方便快捷,成本低廉,可定量,虽然受载体材料对于计数的影响,但不影响对于金黄色葡萄球菌的定性,适合于基层单位的快速检测;免疫学方法则在对于基质复杂的样品检测表现出一定的优越性,其中酶联免疫的商品化的试剂盒只能检测到SEA～SEE,不能检测新型的SE,且无法同时检测多种类型的SE,与其他的方法相结合(如化学发光法等),可以达到提高检测的灵敏度;荧光定量PCR比常规PCR灵敏度和特异性更高,更快速,但由于成本较高,使用上仍然受到限制,适用于要求特异性与灵敏度较高的定量检测;多重PCR可同时检测多种病原菌,若与Real-time PCR相结合,不失为高效检测金黄色葡萄球菌以及其他致病菌的另一途径;LAMP方法不仅在检测的特异性和灵敏度上表现突出,其操作十分简便,设备仅需要恒温仪器,检测迅速,60 min内即可完成检测,检测结果肉眼可见,成本低廉.虽存在引物设计上的复杂性以及基质复杂的样品检测存在一定的局限性,但LAMP法作为一种基层现场快速检测金黄色葡萄球菌的方法,具有良好的应用前景.

表1 金黄色葡萄球菌各种检测技术的比较Tab.1 Comparison of Staphylococcus aureus detection technologies

表2 金黄色葡萄球菌检测的特异性基因Tab.2 Detection of specific genes of Staphylococcus aureus

[1] 中华人民共和国卫生部.化妆品卫生规范[S].北京:中国标准出版社,2007:271-273.

[2] 陈丙卿,王茂起.现代食品卫生学[M].北京:人民卫生出版社,2001:757-758.

[3] 卫生部.GB 4789.10—2010食品安全国家标准:食品微生物学检验—金黄色葡萄球菌检验 [S].北京:中国标准出版社,2010.

[4] Griethuysen A V,Bes M,Etienne J.International multicenter evaluation of latex agglutination tests for identification of Staphylococcus aureus[J].Journal of Clinica Microbiology,2001,39(1):86-89.

[5] Creton R,Jaffe L F.Chemiluminescence microscopy as a tool in biomedical research[J].Biotechniques,2001,31(5):1095-1102.

[6] 刘飞.微孔板式化学发光酶联免疫法检测金黄色葡萄球菌肠毒素B方法的建立及应用[D].西安:第四军医大学,2011.

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[8] 郑华妮,何娅,杨群英.PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素A、E基因[J].实用预防医学,2009,16(1):35 38.

[9] 苏明权,杨柳,马越云,等.实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌方法的试验研究[J].国际检验医学杂志,2010(8):794-796.

[10] Nagamine K,Hase T,Notomi T.Accelerated reaction by loop-mediated isothermalamplication using loop primers[J].Molecular and Cellular Probes,2002,16:223-229.