百合种球脱毒技术研究进展

胡新颖等

摘要：对近年来我国百合种球脱毒技术的研究进展情况进行了综述，介绍了百合常见病毒种类及特点，系统阐述了我国目前常用的百合种球脱毒技术：愈伤组织培养、茎尖培养、热处理、抗病毒药剂应用以及多种方式综合应用等。

关键词：百合；种球；脱毒；研究进展

中图分类号： S682.2+65.04 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0006-03

收稿日期：2013-08-12

基金项目：辽宁省农村科技特派团项目（编号：2012215008）。

作者简介：胡新颖（1980—），女，河北丰润人，硕士，助理研究员，从事花卉栽培、育种与种球繁育技术研究，E-mail：huxinying2013@163.com。

通信作者：颜范悦，研究员，从事花卉栽培、育种与种球繁育技术研究。E-mail：wl401983@163.com。百合（Lilium spp.）为百合科百合属多年生球根类草本植物，因其花大、花色丰富、花形优美而深受人们喜爱，是主要的切花观赏花卉之一。商业上用的百合种球主要以扦插繁殖和分球繁殖等无性繁殖为主。长期的无性繁殖使病毒在百合体内积累，引发病毒病，严重影响切花产量和品质。另外，栽培管理不当，导致温度过高，引发蚜虫危害，使病毒在百合植株间传播，种球带毒率日益增加。采取有效措施控制和消除病毒病，生产优质无毒百合种球，是百合种球商品化生产面临的一个重要问题。目前百合脱毒主要集中在茎尖培养、热处理、应用抗病毒药剂及综合脱毒等方法，本文就百合的病毒病种类及脱毒技术做一系统的综述。

1百合常见病毒病的种类及特点

自Stewart（1896）描述百合的坏死条纹以来，相继报道了百合的病毒病原14种。其中发生普遍，危害严重的病毒有5种，即百合潜隐病毒（lily symptomless virus，LSV）、黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、郁金香碎花病毒（tulip breaking virus，TBV）、异名百合斑驳病毒（lily mottle virus，LMoV）和百合丛簇病毒（lily rosette virus，LRV）。其他9种病毒均在栽培地区少量发生，对百合构不成普遍危害[1]。

近年来，随着百合引种数量的增加、种植面积的扩大，以及不规范的种球自繁，病毒病已开始在我国各百合种植区发生流行，一般发病率为40%～50%，二代种球的带毒率在90%以上，严重制约了我国百合鲜切花的产量和质量。这些病毒在危害百合时有几个突出特点：多种病毒复合侵染，病症复杂、危害重，传播速度快，病毒在植株内分布不均，初侵染与二次侵染特点不同等[2]。病毒病对百合的危害主要有：植株严重矮化，脉明，花叶，畸形，坏死斑，鳞茎变小，产量下降，种质明显退化，开花少且小，有的甚至盲花，严重时整株枯死，影响百合的药用、食用和观赏价值。

2百合脱毒技术研究现状

2.1愈伤组织培养脱毒技术

利用百合鳞片、茎尖等外植体诱导愈伤组织，进而诱导分化无毒试管苗或鳞茎，是脱除百合植株体内病毒的一种途径。据郑丽娜研究表明，百合鳞片通过诱导出愈伤组织，再分化成带叶的小鳞茎，经检测，脱毒率总体偏低，在317%～46.7%之间，此途径暂不能成为百合脱毒的有效途径[3]。此外，愈伤组织在长期无性培养过程中，由于培养基中激素、生长素物质的刺激影响，通常会发生体细胞无性系变异，这种变异的范围和方向都是不定的，因此对于无性繁殖作物而言，为了保持优良性状，一般不采用此法[4]。但是，这种脱毒方式有其自身的优点，比如，实验室可行性强、分化率控制性强、周期较短、一次性成苗数量多等，在马铃薯、天竺葵、大蒜、草莓等植物上应用已先后获得成功，在百合上应用此种脱毒方法有进一步研究的价值和空间。

2.2茎尖培养脱毒技术

茎尖培养脱毒是利用病毒在较老的器官和组织内含量较高，在茎尖等幼嫩的或未成熟的组织和器官中含量较低的原理，剥取茎尖组织培养，脱除植株体内病毒。早在1962年，Phillips就利用茎尖培养成功脱除百合病毒。1966年Mori和Hamaya通过茎尖培养获得了百合无病毒植株。从此，茎尖培养被广泛应用于生产无毒百合种苗。

通过茎尖培养获得无病毒植株的难易程度与品种和感染病毒的种类有直接关系。徐品三等利用不同百合品种的不定芽培养证明了这一点，各品种的再生子球中，“香华丽”百合的LSV和TBV检出率较高，分别是50%和59%，“卡萨布兰卡”百合中的LSV容易脱去，脱毒率达76%，“魅丽”百合中的CMV能全部脱去。其原因可能是它们生长点附近病毒的浓度、维管束分化程度以及细胞代谢活性不同的缘故[5]。

采用茎尖培养时切取茎尖的大小是研究人员一直在探求的问题。切取茎尖太大，成活率高，但脱毒效果差；切取茎尖太小，脱毒率虽高，但操作不方便。因此，选择适当的茎尖大小，兼顾成活率和脱毒率2个因素，是成功利用茎尖培养获得脱毒原种球的关键。邵增龙等认为剥取0.2～0.3 mm 的茎尖分生组织进行培养的脱毒效果较好且易成活[6]。张文珠等研究表明，直接剥取0.2～0.5 mm的茎尖，脱毒率达38%[7]。朱旭东等先用鳞片诱导分化不定芽，再利用无菌不定芽剥取0.5 mm以下茎尖进行培养，降低了污染率，提高了成活率且节省了材料，但脱毒效果一般[8]。钟海丰等认为新鲜百合种球经4 ℃冷藏处理1个月后剥取0.2 mm茎尖培养的脱毒方法，既提高出芽率，也达到了较理想的脱毒率，是百合脱毒的较好方法[9]。综上所述，茎尖培养切取茎尖的最适大小为0.2～0.5 mm。操作需在解剖镜下进行。

茎尖二次脱毒是对茎尖培养方法的改进，具有简便、易掌握、速度快、分化率高、脱毒率高、污染率低等特点。郑丽娜等一次剥取茎尖0.2～0.4 mm，培养成苗后，剥取无根苗的茎尖（0.4～0.6 mm）进行二次脱毒培养，脱毒率都在75%以上[3]。侯娜研究表明，2～3 mm组培苗茎尖经过1次茎尖培养+4次继代脱毒处理后，CMV和LSV的脱毒率都能达到100%[10]。

靳慧洁报道的茎尖超低温脱毒技术[11]是一条新的脱毒途径。试验表明，继代后20 d的百合组培苗，经超低温处理，在 40 ℃ 水浴化冻后，切取0.5～0.8 mm的茎尖，脱毒率、成活率较高，生长较快，整个操作简单易行，可达到大规模实际生产的需求。

2.3热处理与茎尖培养结合的脱毒技术

热处理是根据病毒在高温下出现钝化，其复制明显减弱或停止，植物在高温培养期间生长的嫩稍不带病毒，取其嫩梢进行培养从而达到脱毒的目的。热处理脱毒法已应用多年，被世界多个国家利用。该项技术要求的设备条件比较简单，脱毒操作也较容易。主要缺点是脱毒时间长，脱毒不完全，若温度过高或处理时间太长，又会降低植株的成活率。此外，由于温度难以控制以及各病毒对温度的敏感范围不一样，很难获得理想的控制效果。因此，目前百合脱毒技术研究中，热处理多与茎尖培养脱毒结合应用，能达到较好的脱毒效果。

热处理与茎尖培养相结合的方式基本有2种：一是先对鳞茎或试管苗进行热处理，然后切取茎尖检测脱毒效果，相关研究报道较多。徐品三等以“铁炮”百合感病种球为材料，对其进行37 ℃热处理20 d后再进行组织培养，子球再生率仅为40%左右，但LSV脱毒率达95%以上[12]。陈剑勇以“索蚌”小鳞茎为外植体，采用50 ℃热水处理30 min结合茎尖培养，脱毒率可达80%，直接茎尖培养的脱毒率仅为30%[13]。吴斌等将带LSV、CMV、LMoV的百合子球放入恒温箱中，35 ℃ 左右培养4周后病毒含量明显降低。剥取0.4～0.6 mm茎尖2次脱毒，4个月后组培苗带毒率降为0%[14]。周晓波等以带LSV的“卷丹珠”芽为材料，36 ℃处理10 d后，剥取0.2 mm大小的茎尖进行培养，脱毒率达100%[15]。刘芬等研究表明，花丝培养结合37±2 ℃热处理28 d后，切取0.8～1.0 mm的茎尖再生芽脱毒效果最好，脱毒率达80%以上[16-17]。江洪如等将“龙牙”百合鳞茎在58 ℃处理10～20 min，再在38 ℃温度下热处理72 h，结合0.2～0.4 mm茎尖培养，可完全脱去LSV、CMV和LMoV[18]。罗丽萍等以“龙牙”百合组培小鳞茎为试材，白天40～42 ℃、夜晚35 ℃热处理60 d后，剥取0.2～0.3 mm的茎尖进行培养，成活率和脱毒率都较高[19]。陈丽等将“卷丹”鳞茎经28～30 ℃高温催芽后，剥取小于0.2 mm的微生长点进行培养，脱毒率达100%[20]。不同的百合品种经热处理后脱毒效果是有差异的。姜春华对东方系百合的不同品种进行2次递进热处理和茎尖脱毒。结果表明，高温处理的最理想温度是40～45 ℃，热处理后剥取0.2～0.6 mm的茎尖进行脱毒培养，“西伯利亚”的脱毒率为100%，吸光度值低，脱毒彻底；“凝星”的脱毒率为100%，但吸光度值高，脱毒不彻底，效果一般[21]。

另一种热处理方式是先剥取茎尖，再对试管苗进行高温培养，也能达到较好的脱毒效果。张文珠等以带毒的Tiber为试材，茎尖培养结合热处理，脱毒率达60%[7]。刘博剥取带有LSV病毒的Tiber商品球的茎尖约 2 mm，结合白天 38 ℃ 10 h，夜间32 ℃ 14 h全暗培养，脱毒率达100%[22]。高慧卿等以品种Tiber初代培养的无菌苗为材料，切取0.2～0.5 mm的茎尖结合65 ℃热处理30 min再进行脱毒培养，LSV的脱毒效果优于茎尖培养[23]。张艺萍等将带有CMV的Siberia组培苗经（39±1） ℃热处理后，2次剥取0.4～0.6 mm的茎尖培养，脱毒率可达80%[24]。

热处理与茎尖培养相结合之所以能够提高脱毒效果，是由于热处理可使植物生长本身所具有的顶端免疫区得以扩大，有利于切取较大的茎尖，从而提高组织培养的成活率[3]。先对鳞茎进行热处理再茎尖脱毒的方式，在切取茎尖大小相同的情况下，更有利于提高试管苗的成活率，更适合大规模脱毒原种球的生产。

2.4热处理+茎尖培养+抗病毒药剂综合脱毒技术

化学疗法即抗病毒药剂处理，是一种新的脱毒方法，在外植体培养时添加抑制植物病毒活性的化学物质，如病毒唑（virazole ）或硫尿嘧啶（2-thiouracil）等，以达到减轻病毒危害的目的。其作用原理是：抗病毒药剂在三磷酸状态下会阻止病毒RNA帽子结构形成，抑制病毒增殖或移动。徐品三等研究表明，将检测出LSV的“卡萨布兰卡”鳞片组培形成的不定芽，移植在添加DHT的液体培养基上培养，2周后转接到固体培养基中，经检测脱毒率达到100%[5]。

单独应用抗病毒药剂脱除百合病毒也较少见，一般都是与茎尖培养、热处理相结合应用，脱毒效果较好。徐榕雪试验表明，病毒唑处理浓度为4 mg/L，茎尖大小为 0.5～0.7 mm，能保证较高的成活率和脱毒率，且操作简便、成苗快[25]。王超等研究表明，种球38 ℃光照处理 16 h，25 ℃ 黑暗处理 8 h，待地上部分长出10 cm左右高时，切取0.5～0.8 mm茎尖，接种于含病毒唑10 mg/L的培养基中，脱毒效果最好[26]。郑丽娜等对种球做相同热处理，再剥取 0.8～1.2 mm 茎尖，置于含6 mg/mL病毒唑的培养基中培养15 d，脱毒效果最佳，一次性脱毒率可达到80%以上[27]。张惠华等以2～4 ℃冷库休眠84 d、15 ℃室内7 d催芽处理后的“索蚌”种球为试材，在39 ℃（±1 ℃）恒温处理15 d，剥取茎尖大小为0.4～0.5 mm，病毒唑处理浓度为 10 mg/L 时，脱除病毒效果最好[28]。马平霞研究表明，2～3 cm的试管苗放入38 ℃ 16 h光照和25 ℃ 8 h黑暗的培养箱中热处理42 d后，切取茎尖0.3～0.5 mm，接种于含5 mg/L病毒唑的分化培养基上，脱毒率最高达67.5%[29]。

综上所述，单一的脱毒处理技术难以完全脱除病毒，或需要较长的时间，热处理+茎尖培养+抗病毒药剂的综合脱毒技术是目前生产无毒百合种球最佳的途径。