茄子青枯病诱导的cDNA文库构建与鉴定

蒋晶等

摘要：以茄子抗青枯病自交系E-31为材料，在4叶期接种青枯病菌，48 h后采集叶片提取RNA，利用Gateway技术构建茄子uncut型cDNA文库。经检测，本研究获得的茄子叶片cDNA文库滴度达到0.01亿CFU/mL，总库容量为0.15亿CFU，平均插入片段长度在1.2 kb以上，重组率为100%。说明构建的文库能达到所需要的标准，可用于分离茄子的功能基因。

关键词：uncut型cDNA文库；Gateway技术；茄子；青枯病

中图分类号： S641.101 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0022-03

收稿日期：2013-08-31

基金项目：国家自然科学基金（编号：30972005）；广东省自然科学基金（编号：9151064201000063）；广东省自然科学基金研究团队项目（编号：S2011030001410）；广东省教育厅华南园艺作物种质资源利用与改良重点实验室项目（编号：KBL11008）。

作者简介：蒋晶（1990—），女，湖南宁乡人，硕士研究生，主要从事茄子抗青枯病基因功能鉴定。E-mail：92157135@qq.com。

通信作者：曹必好，教授。Tel：（020）85280228；E-mail：caobh01@163.com。茄子（Solanum melongena L.）是一种在亚洲、地中海、中欧及东南欧地区广泛栽培的蔬菜作物[1]。在高温高湿的季节，茄子易受青枯病害的侵袭，发病严重时可造成产量和品质的大幅下降，已成为影响茄子高产的主要因素[2]。目前，有关茄子抗青枯病的分子育种进展缓慢，茄子对青枯病的抗性分子机制仍然不清楚，若要解析这些机理，必须分离出相关抗性基因以及互作基因，并对它们进行功能鉴定，这对开展持久、广谱的茄子抗病分子育种具有重要的意义[3]。构建一个完整的cDNA文库是开展分子生物学研究的基础，也是克隆新基因和研究基因功能的有效策略之一[4-6]。未剪切cDNA文库构建的基本原理是采用Invitrogen专利的Gateway位点特异性重组技术，将mRNA转变成两头带有attB重组位点的双链cDNA，通过定点重组，cDNA被定向克隆到Gateway的供体载体，从而产生初级文库，该初级文库可以通过和各种Gateway目的载体进行Gateway LR重组，构建成为不同的表达文库[7-9]。未剪切cDNA文库的全长比例和库容量等均优于标准cDNA 文库。目前有关茄子cDNA 文库的构建报道不多，本研究应用 Gateway 技术构建高质量的茄子未剪切型 cDNA 文库，旨在为未来分离有用的功能基因打下基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试材料本试验材料为茄子高抗自交系E-31，由华南农业大学曹必好教授提供。

1.1.2试剂pDONR222，CloneMiner Ⅱ cDNA Library Construction Ki，TRIzol Reagent，FastTrack MAG mRNA isolation Kit，SuperScript Ⅲ，Platinum Taq DNA Polymerase均购自 Invitrogen 公司。

1.2方法

1.2.1青枯病接种青枯病菌为生理小种1，从田间发病植株中分离得到。青枯病菌在斜面培养基上培养，培养基为肉汁胨培养基（基本培养基成分：牛肉浸膏3 g、蛋白胨5～10 g、蔗糖 10 g、琼脂17～20 g、蒸馏水1 000 mL、 pH值7.0），在恒温 30 ℃ 下增殖培养24 h。分离时在基本培养基上加入005%氯化三苯四氮唑（TZC），挑起白色流动性强菌落，在未加琼脂的上述培养基上进行培养。将增殖培养的病原菌菌液加无菌水稀释。用紫外分光光度计在波长650 nm处测定病菌浓度，将菌液浓度调制成1亿CFU/mL悬浊液。在幼苗为4叶期时，采用伤根-蘸根法人工接种，菌液浓度为1亿CFU/mL浸根，时间为20 min。把幼苗定植于营养钵中，放入恒温培养箱中30 ℃培养48 h，采集叶片提取RNA。

1.2.2总RNA的提取及mRNA的分离取1 g组织样品，采利用Trizol提取样品的总RNA。取500 μg提取的总RNA，冰上融化放置，加DEPC水置总体积500 μL，参照FastTrack MAG mRNA isolation Kit说明书进行mRNA的分离纯化。用1% 琼脂糖凝胶电泳检测总RNA及mRNA的纯度和质量。

1.2.3cDNA的合成（1）cDNA第一链的合成参照CloneMiner说明书进行。将2 μg mRNA溶于10 μL DEPC水中，加入 biotin-attB2-Oligo（dT） Primer （30 pmol） 1 μL混匀，65 ℃ 5 min，降温到45 ℃孵育2 min，加入5 × First Strand Buffer 4 μL，0.1 mol/L DTT 2 μL，dNTPs（10 mmol/L）1 μL，45 ℃ 孵育2 min；最后加入200 U/μL SuperScript Ⅱ RT 2 μL 混匀，置于PCR仪上反应45 ℃ 20 min、50 ℃ 20 min、55 ℃ 20 min。（2）cDNA第二链的合成。在上述溶液中加入DEPC水 91 μL，5×Second Strand Buffer 30 μL，dNTPs （10 mmol/L）3 μL，大肠肝菌DNA Ligase（10 U/μL） 1 μL，大肠杆菌DNA PolymeraseⅠ（10 U/μL） 4 μL 大肠杆菌RNaseH（2 U/μL）1 μL混匀，16 ℃条件下反应2 h；最后加入T4 DNA Polymerase 2 μL，16 ℃，反应 5 min。将获得的双链cDNA纯化，溶解于DEPC水中。

1.2.4cDNA与attB1重组接头连接将下列组分加入到 6 μL 双链cDNA中，使得cDNA双链加入attB1接头：5×Adapter Buffer 10 μL，attB1 Adapter （1 μg/μL） 10 μL，0.1 mol/L DTT 7 μL，T4 DNA Ligase（1 U/μL）5 μL，DEPC水12 μL混匀后 16 ℃ 保温20 h。

1.2.5BP重组反应及文库的构建取cDNA 13 μL于 20 μL 反应体系[pDONR222 （250 ng/μL）2 μL，BP Clonase Ⅱ enzyme mix 5 μL]混匀后置于25 ℃下反应20 h，进行BP重组。利用电转化法将重组质粒转入大肠杆菌DH10B中。将转化的大肠杆菌置于37 ℃、225～250 r/min摇床上培养 1 h，加入甘油至终浓度20%存于-80 ℃，即得文库菌液。

1.2.6cDNA文库质量鉴定

1.2.6.1库容量的鉴定取转化后细菌原液10 μL稀释 1 000 倍后，从中取出50 μL涂布LB平板（卡那霉素，工作浓度是50 μg/mL）上，第2天计数。文库菌液的单位菌落数（CFU/mL）=平板上的克隆数/50 μL×1 000倍×1 000 μL，文库总菌落数（CFU）=文库菌液的单位菌落数（CFU/mL）×文库菌液总体积（mL）。

1.2.6.2重组率和插入片段长度鉴定随机挑取24个克隆进行菌落PCR鉴定，在Microtube中配制总体积为20 μL的反应液[ddH2O 16.2 μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，M13F（20 μmol/L）0.5 μL，M13R（20 μmol/L）0.5 μL，DNA Polymerase（5 U/μL）0.3 μL]，放置在Thermal Cycler PCR仪上进行PCR反应，扩增程序为：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃保温5 min。扩增结束后，扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。M13F：TGTAAAACGACGGCAGT；M13R：CAGGAAACAGCTATGACC。

2结果与分析

2.1RNA及mRNA质量

提取的总 RNA 在琼脂糖凝胶上进行电泳，从电泳结果中可看到 28S、18S、5S等3条清晰的电泳条带（图1），28S与18S的亮度比接近2 ∶1，D260 nm/D280 nm及D260 nm/D230 nm的值在1.9～2.0之间，表明该样品总RNA基本上没有降解，完整性良好，无蛋白质和多糖的污染，可以作为起始样品用于文库构建。mRNA电泳结果为一片模糊的拖带（图1），这是由于mRNA的长度不一所造成的，且拖带最亮部分的范围在较大的分子量范围内（大于500 bp），由此可以认定mRNA未出现降解，完整性较好。

2.2文库质量鉴定

2.2.1总克隆数CFU的鉴定LB平板37 ℃ 过夜培养，在平板上长出75个单一克隆（图2）。根据公式得到其单位菌落数（平板稀释度1 ∶1 000）=75/50 μL×1 000×1 000=0015亿CFU/mL，文库总库容量=0.015亿CFU/mL×10 mL=0.15亿CFU。

2.2.2插入片段大小及重组率鉴定随机挑取的24个克隆PCR产物经凝胶电泳检测，平均插入片段长度在1.2 kb以上，重组率为100%（图3）。

按照CloneMiner cDNA Library Construction Kit的要求，一个高质量文库的滴度应大于0.01亿CFU/mL，文库总容量大于500万CFU，阳性克隆率大于95%，平均插入片段大于或等于1.5 kb。由此可见，本研究构建的茄子叶片cDNA文库是一个质量较高的文库。

3结论与讨论

植物组织中的RNA含量较低，且离体植物组织的 RNA 降解速度很快。RNA提取是分子生物学的基本技术之一，其困难首先是RNA非常容易降解而RNase又无处不在，并且非常稳定；其次是组织中的次生物质如酚类、多糖等也会影响RNA的质量[10-11]。

在本试验中cDNA的分级分离是一个不可忽视的环节。用凝胶柱除去已消化的接头碎片和小片段的cDNA分子，收集片段大小合适的cDNA样品。这样保证了文库中cDNA具有较大的分子，对筛选有重要意义，可明显减少后期筛选的工作量。

未剪切cDNA文库构建的基本原理是采用Invitrogen专利的Gateway位点特异性重组技术，其优点在于无需使用限制性内切酶和连接酶，基本克服了常规cDNA文库构建方法中存在的被限制性内切酶切开而无法得到完整的基因序列，以及连接效率不高的缺陷[12]。一个高质量cDNA文库的关键就是要保证文库的完整性与覆盖度[13]。本试验所构建的茄子cDNA文库，插入片段绝大多数在1.2 kb以上，文库总容量达到0.15亿CFU，重组率达到100%，而一般的普通的cDNA文库滴度只需要0.01亿CFU/mL，重组率达到80%以上，插入片段的大小达到500 bp以上的标准，由此可见，本研究所构建的cDNA是高质量的cDNA文库。

cDNA便于克隆和大量表达，它不像基因组含有内含子而难以表达，因此，可以从cDNA文库中筛选到所需要的目的基因，并且可直接用于该目的基因的表达[14]。cDNA文库构建目前己广泛应用于不同发育阶段基因表达的变化、某特定发育期基因表达的分子机制、克隆新型细胞因子、分离新的组织特异基因等方面的研究[15-21]。随着cDNA文库构建技术的日益提高和普及，cDNA文库已成为克隆相关基因的一种首选方法，在基因操作过程中具有十分广泛的基础性作用，近年来，构建cDNA文库已在植物抗病虫、抗逆境分子机理等研究领域广泛应用[22-26]。

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