高效液相色谱法测定核桃青皮中胡桃醌的含量

李青　谭红　袁鑫　何锦林　魏赫楠　李占彬

摘要：应用高效液相色谱原理建立核桃青皮中胡桃醌活性成分的分析测定方法，该方法的线性回归方程为y=598 860x-49 983（r2=0.999 1），线性范围为10～150 μg/mL，该方法的精密度、稳定性、重复性良好，回收率为 93.90%～95.14%，相对标准偏差小于2%。

关键词：高效液相色谱；胡桃醌；核桃；青皮

中图分类号：O657.7+2文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）01-0259-02

收稿日期：2013-06-05

基金项目：贵州省林业科研技术基金（编号：黔林科合J字[2012]18号）；国家国际科技合作专项（编号：2011DFB41640）。

作者简介：李青（1987—），男，湖南益阳人，硕士，主要从事仪器分析方法的开发研究。E-mail：287476045@qq.com。胡桃醌是核桃青皮中的有效成分，具有抗肿瘤、抑菌及抗病毒、抗氧化等活性，目前已被应用于医药方面的研究[1]。高效液相色谱的分离原理与其他色谱法相同，都是利用混合物中各组分在固定相和流动相之间的分配系数不同而被分别分离的原理[2]。现在使用的微处理机控制的高效液相色谱仪，其自动化程度非常高，不仅能控制仪器的相关操作参数（如溶剂的梯度洗脱、流动相流量与流速、柱温、自动进样、洗脱液收集、检测器功能等），而且还能对获得的色谱图进行收缩、放大、叠加，并对保留时间和峰高、峰面积进行综合处理，使色谱分析工作者能高效率、高质量、高标准地完成分析工作[3]，因此它在天然产物中活性物质的研究及植物药的发展中起着非常重要的作用。天然产物中活性物质不像化学药品那样简单、规范、物质单一，它们不仅有着非常复杂的成分，而且各种成分之间可能会相互影响和相互作用。因此，根据不同的分析对象、目的以及要求，可以利用高效液相色谱技术对天然产物某一成分化合物建立高效、灵敏、准确的分析方法或定量方法。本试验就是利用高效液相色谱技术，建立了一种对胡桃醌含量的高效、快速的HPLC检测方法。

1材料与方法

1.1材料

核桃主要由贵州省赫章县提供。

97%胡桃醌标准品（Sigma公司）、磷酸、磷酸氢二钠、无水乙醇、氯仿、氢氧化钠均为分析纯，甲醇为色谱纯。

Agilent1100高效液相色谱仪，PHS-3C型精密pH计（上海精密科学仪器有限公司），XS-20B粉碎机（上海兆申电子科技有限公司），ALC-110.4电子天平（北京赛多利科学仪器有限公司），RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），H-1850R型高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），101-2AB型电热鼓风干燥箱（天津泰斯特仪器有限公司），SC-316冰箱（山东省青岛海尔股份有限公司），78-1型磁力搅拌器（江苏省常州澳华仪器有限公司），KQ-50型超声波清洗器（江苏省昆山市超声波仪器有限公司）。

1.2方法

1.2.1色谱条件色谱柱选用C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相采用甲醇-水（体积比1 ∶1），水相先用磷酸调节pH值约为4，流速为0.8 mL/min，紫外检测波长为 250 nm，柱温为 30 ℃。

1.2.2胡桃醌标准溶液的制备精确称取胡桃醌标准品 5.0 mg，置于25 mL容量瓶中，加入甲醇溶解（在超声波清洗器上振荡5 min后）在室温下冷却后再用甲醇定容，摇匀，即得200 μg/mL胡桃醌标准溶液。

标准溶液须放在冰箱中保存，防止甲醇挥发和长时间放置在阳光下使标准溶液物质分解，给试验带来误差。

1.2.3最大吸收波长的测定和选择对胡桃醌标准溶液在220～400 nm的范围内进行紫外光谱扫描，选定检测波长。

1.2.4流动相组成的确定以甲醇-水体系作为流动相，进行等度洗脱。固定流动相的流速为0.8 mL/min。为了选择最佳的流动相配比，改变流动相中甲醇的比例，使其体积分数分别为20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，测定胡桃醌标准溶液的保留时间和峰面积。

1.2.5pH值的确定常用来调节流动相pH值的化合物有磷酸、醋酸、磷酸盐缓冲溶液和醋酸盐缓冲溶液。本试验采用磷酸来调节pH值而不采用醋酸的主要原因是磷酸的紫外吸收较小且属于中等强酸，等量的0.1%磷酸溶液和1%醋酸溶液的pH值相等，除此之外，磷酸还不损坏色谱仪器的接口。

用磷酸调节水相的pH值分别为2、3、4、5、6、7，加入流动相中的有机相和水相的体积比为1 ∶1，测定不同pH值下胡桃醌标准溶液的保留时间和峰面积。

1.2.6柱温的选择本试验考察了温度对色谱分离的影响，在选定的上述条件下，分别在柱温为18、22、26、30、34、38、42 ℃ 时测定胡桃醌标准溶液的保留时间和峰面积。

1.2.7标准曲线的建立用甲醇稀释200 μg/mL胡桃醌标准溶液，制备质量浓度为10、20、50、100、120、150 μg/mL 系列标准品工作溶液，按照上述确定的色谱条件测定标准品系列工作溶液的峰面积，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标作工作曲线，求得标准曲线方程。

1.2.8精密度试验取质量浓度分别10、50、100 μg/mL标准溶液，按照已经确定的色谱条件，各进样3次，分别测定峰面积并计算胡桃醌浓度、相对标准偏差（RSD）。

1.2.9稳定性试验将20 μg/mL标准溶液放置在室温条件下，不做任何避光保护，每隔2 h进样测定1次，共进行5次，分别测定其峰面积并计算胡桃醌浓度、相对标准偏差。

1.2.10重复性试验取20 μg/mL标准溶液5份，按上述色谱条件连续进样，分别测定峰面积并计算胡桃醌浓度、相对标准偏差。endprint

1.2.11加标回收率试验分别取3份5 mL 50 μg/mL的标准溶液，分别加入0.5、0.8、1.0 mL 200 μg/mL胡桃醌标准溶液，按照上述进样方法操作，测定其峰面积，重复测定3次，计算平均回收率、相对标准偏差。

2结果与分析

2.1最大吸收波长的测定和选择

由图1可知，胡桃醌的最大吸收波长出现在250 nm左右，此时受干扰较少。因此选择250 nm为测定波长。

2.2流动相组成的影响试验

从图2可以看出，随着水的比例增加，流动相的极性增大，保留时间也延长。当甲醇的体积分数小于50%时，分析时间过长，峰形开始逐渐变差。综合以上情况，选用甲醇的体积分数为50%（即甲醇与水体积比为1 ∶1）。

2.3pH值的影响试验

流动相中水相的pH值在2～7范围对胡桃醌的保留时间（图3）和峰面积都没有太大的影响，但当pH值为4时，峰型较好，因此本试验中选取水相的pH值为4。

2.4柱温的选择试验

试验结果（图4）表明：随着温度升高，各物质之间的分离效果有所提高，当温度高于30℃，分离效果随着温度升高变

化不再明显，考虑到色谱柱使用温度条件，选择柱温30 ℃。

2.5标准曲线的建立

以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标作工作曲线，得到图5，对曲线进行线性拟合，得到胡桃醌含量的标准曲线方程为y=598 860x-49 983（r2=0.999 1），表明胡桃醌在 10～150 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.6精密度试验

由表1可知，高、中、低3个不同水平的标准品溶液RSD值均小于2%，表明仪器及进样的精密度良好。

参考文献：

[1]许绍惠，许弘. 胡桃属植物毒性成分及其应用[J]. 沈阳农业大学学报，1990，21（2）：167-170.

[2]朱明华，胡坪. 仪器分析[M]. 北京：高等教育出版社，2008：66-67.

[3]孟霞. 高效液相色谱法在几种药用植物分析中的应用研究[D]. 重庆：西南大学，2009.高渊，朱君，吕飞，等. 江苏口岸截获入境皮蠹疫情分析 [J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：261-262.endprint

1.2.11加标回收率试验分别取3份5 mL 50 μg/mL的标准溶液，分别加入0.5、0.8、1.0 mL 200 μg/mL胡桃醌标准溶液，按照上述进样方法操作，测定其峰面积，重复测定3次，计算平均回收率、相对标准偏差。

2结果与分析

2.1最大吸收波长的测定和选择

由图1可知，胡桃醌的最大吸收波长出现在250 nm左右，此时受干扰较少。因此选择250 nm为测定波长。

2.2流动相组成的影响试验

从图2可以看出，随着水的比例增加，流动相的极性增大，保留时间也延长。当甲醇的体积分数小于50%时，分析时间过长，峰形开始逐渐变差。综合以上情况，选用甲醇的体积分数为50%（即甲醇与水体积比为1 ∶1）。

2.3pH值的影响试验

流动相中水相的pH值在2～7范围对胡桃醌的保留时间（图3）和峰面积都没有太大的影响，但当pH值为4时，峰型较好，因此本试验中选取水相的pH值为4。

2.4柱温的选择试验

试验结果（图4）表明：随着温度升高，各物质之间的分离效果有所提高，当温度高于30℃，分离效果随着温度升高变

化不再明显，考虑到色谱柱使用温度条件，选择柱温30 ℃。

2.5标准曲线的建立

以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标作工作曲线，得到图5，对曲线进行线性拟合，得到胡桃醌含量的标准曲线方程为y=598 860x-49 983（r2=0.999 1），表明胡桃醌在 10～150 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.6精密度试验

由表1可知，高、中、低3个不同水平的标准品溶液RSD值均小于2%，表明仪器及进样的精密度良好。

参考文献：

[1]许绍惠，许弘. 胡桃属植物毒性成分及其应用[J]. 沈阳农业大学学报，1990，21（2）：167-170.

[2]朱明华，胡坪. 仪器分析[M]. 北京：高等教育出版社，2008：66-67.

[3]孟霞. 高效液相色谱法在几种药用植物分析中的应用研究[D]. 重庆：西南大学，2009.高渊，朱君，吕飞，等. 江苏口岸截获入境皮蠹疫情分析 [J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：261-262.endprint

1.2.11加标回收率试验分别取3份5 mL 50 μg/mL的标准溶液，分别加入0.5、0.8、1.0 mL 200 μg/mL胡桃醌标准溶液，按照上述进样方法操作，测定其峰面积，重复测定3次，计算平均回收率、相对标准偏差。

2结果与分析

2.1最大吸收波长的测定和选择

由图1可知，胡桃醌的最大吸收波长出现在250 nm左右，此时受干扰较少。因此选择250 nm为测定波长。

2.2流动相组成的影响试验

从图2可以看出，随着水的比例增加，流动相的极性增大，保留时间也延长。当甲醇的体积分数小于50%时，分析时间过长，峰形开始逐渐变差。综合以上情况，选用甲醇的体积分数为50%（即甲醇与水体积比为1 ∶1）。

2.3pH值的影响试验

流动相中水相的pH值在2～7范围对胡桃醌的保留时间（图3）和峰面积都没有太大的影响，但当pH值为4时，峰型较好，因此本试验中选取水相的pH值为4。

2.4柱温的选择试验

试验结果（图4）表明：随着温度升高，各物质之间的分离效果有所提高，当温度高于30℃，分离效果随着温度升高变

化不再明显，考虑到色谱柱使用温度条件，选择柱温30 ℃。

2.5标准曲线的建立

以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标作工作曲线，得到图5，对曲线进行线性拟合，得到胡桃醌含量的标准曲线方程为y=598 860x-49 983（r2=0.999 1），表明胡桃醌在 10～150 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.6精密度试验

由表1可知，高、中、低3个不同水平的标准品溶液RSD值均小于2%，表明仪器及进样的精密度良好。

参考文献：

[1]许绍惠，许弘. 胡桃属植物毒性成分及其应用[J]. 沈阳农业大学学报，1990，21（2）：167-170.

[2]朱明华，胡坪. 仪器分析[M]. 北京：高等教育出版社，2008：66-67.

[3]孟霞. 高效液相色谱法在几种药用植物分析中的应用研究[D]. 重庆：西南大学，2009.高渊，朱君，吕飞，等. 江苏口岸截获入境皮蠹疫情分析 [J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：261-262.endprint