无锡地区汉族人群RAGE基因启动子区-374T/A多态性与糖尿病视网膜病变的相关研究△

顾喆瑶 姚勇 谢田华 曹葭 邹健

无锡地区汉族人群RAGE基因启动子区-374T/A多态性与糖尿病视网膜病变的相关研究△

顾喆瑶 姚勇 谢田华 曹葭 邹健

晚期糖基化终末产物受体；基因多态性；糖尿病视网膜病变

目的探讨无锡地区汉族人群RAGE基因启动子区-374T/A多态性与糖尿病视网膜病变(diabetes retinopathy,DR)的相关性。方法运用聚合酶链反应直接测序法检测120名正常人及185名2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者，包括DR患者92例，无糖尿病视网膜病变(non-diabetes retinopathy,NDR)患者93例的基因型。比较各组受检者基因型和基因频率及生化指标。结果DR组患者糖尿病病程明显长于NDR组(t=2.254,P=0.01)，两组间其他临床特征的差异均无统计学意义(均为P>0.05);DR组、NDR组及对照组AA基因型频率为6.5%、2.2%、3.3%，A等位基因频率分别是23.9%、14.0%、15.4%；DR组AA基因型及A等位基因频率分布显著高于NDR组及对照组，其差异有统计学意义(P=0.026、P=0.015；P=0.035、P=0.027)。NDR组与对照组的各基因型和等位基因频率分布比较，差异无统计学意义(P>0.05)。单因素Logistic回归分析示，A等位基因是T2DM人群DR发病的危险因素(OR=1.934，95%CI:1.132～3.303)。结论RAGE基因启动子区-374T/A多态性与无锡地区DR的发生有一定的相关性，且A等位基因可能是其危险因素。

[眼科新进展，2014，34(7):655-657，661]

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者最主要的致盲因素，其发生不仅和血糖控制、病程等因素有关，遗传因素也起到了一定的作用。大量实验表明，长期高血糖可激活晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)及其受体(receptor for advanced glycation end products，RAGE)信号转导通路，诱导细胞内氧化应激，促进视网膜微血管生成，是导致DR的重要原因之一[1]。RAGE作为AGEs发挥生物活性的关键受体，其基因表达异常或活性改变，势必影响DR的发生。目前已发现许多RAGE基因多态性，但这些基因多态性与DR的相关性研究结果仍存在争议[2-4]。本文主要探讨无锡地区汉族人群RAGE基因启动子区-374T/A多态性与DR的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料收集无锡地区明确诊断的T2DM患者(按1999年WHO制定的诊断标准)185例作为研究对象，其中男91例，女94例，年龄(62.72±8.22)岁；入选标准:无锡地区汉族人群，个体间无亲缘关系；年龄≥50周岁，病程≥10 a，并排除DR以外眼部疾病。对所有患者检测眼压、视力，并行裂隙灯显微镜、眼底检查及荧光素眼底血管造影(fluorescein fundus angiography,FFA)。根据2002年DR国际临床分型标准，将T2DM患者分为无糖尿病视网膜病变(non-diabetes retinopathy,NDR)组和DR组。DR组患者92例，男45例，女47例，年龄(63.60±7.23)岁；NDR组患者93例，男46例，女47例，年龄(61.85±9.06)岁；对照组为年龄、性别、地区与病例组相匹配的120名健康者，男61人，女59人，年龄(61.35±9.20)岁，均来自无锡市人民医院体检中心。记录所有受检人员的姓名、性别、年龄以及空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)、甘油三酯、总胆固醇(total cholesterol，TC)等生化指标。本研究经江苏省南京医科大学伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2聚合酶链反应-直接测序分析方法

1.2.1基因组DNA提取抽取所有受检人员外周静脉血3 mL,体积分数2%EDTA抗凝，采用DNA提取试剂盒(Promega公司)提取基因组DNA，所提DNA均使用紫外分光光度仪检测纯度和含量。

1.2.2体外目的基因扩增引物设计参考文献[5],扩增片段为RAGE基因启动子区包括-374位点在内的250个碱基对。上游引物:5’-GGGGCAGTTCTCTCCTCACT-3’，下游引物:5’-GGTTCAGGCCAGACTGTTGT-3’，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应体系25 μL:2×GoldStar Taq Master Mix酶(北京康为世纪生物科技有限公司)12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA 0.5 μL，灭菌双蒸水10 μL；反应条件:95 ℃初步变性5 min，30个循环周期后冷却至4 ℃，每个循环包括:95 ℃变性45 s，67 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s。PCR产物经20 μg·L-1溴化乙啶染色，20 g·L-1琼脂糖凝胶电泳，并在紫外凝胶系统成像下检测后测序，测序由上海生工生物工程有限公司完成。

2 结果

2.1DR组与NDR组基本临床资料分析DR组的病程为(14.22±4.22)a，明显长于NDR组的病程(12.78±3.40)a(t=2.254,P=0.01)；两组间收缩压(systoic blood pressure，SBP)、舒张压(diastolic blood pressure,DBP)、FPG、TC、糖化血红蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)、甘油三酯、体质量指数(body mass index，BMI)的差异均无统计学意义，一般临床资料详见表1。

2.2各组RAGE多态性比较各组基因型和基因频率详见表2。

测序结果显示:试验组和对照组人群的RAGE基因启动子区-374位点均存在A、T两种等位基因及AA、AT、TT三种基因型(图1-图2)，其基因型分布经χ2检验均符合HWE 平衡(均为P>0.05)，说明本次研究人群具有很好的群体代表性。表2显示了各组间RAGE-374位点基因型及基因频率分布结果，其中DR组、NDR组及对照组AA基因型频率为6.5%、2.2%、3.3%，A等位基因频率分别是23.9%、14.0%、15.4%，DR组AA基因型及A等位基因频率分布显著高于NDR组(χ2=4.985，P=0.026；χ2=5.951，P=0.015)及对照组(χ2=4.455，P=0.035；χ2=4.865，P=0.027)，而TT基因型及T等位基因频率分布明显降低，其差异有统计学意义。NDR组与对照组的各基因型和等位基因频率分布比较，差异无统计学意义(χ2=0.077，P=0.782；χ2=0.172，P=0.678)。单因素Logistic回归分析结果显示:RAGE基因启动子区-374多态性位点携带A等位基因T2DM人群的DR发病风险是携带T等位基因的1.934倍(OR=1.934，95%CI:1.132～3.303)。

表1 DR组与NDR组一般临床资料分析Table 1 Comparison of demographics characteristics between DR group and NDR group(±s)

表2 各组间RAGE-374位点基因型及基因频率分布比较Table 2 Distribution of RAGE -374T/A genotype and allele frequency(n，rate/%)

Figure 1 PCR amplification products electrophoresis results of RAGE -374T/A.M:Marker;1-6:Target bands RAGE基因-374位点PCR扩增产物电泳结果。M:Maker;1～6:目的条带

Figure 2 Sequencing results of PCR amplification products of RAGE -374T/A.Inside of the box was the target genotype(-374) TA(A),AA(B),TT(C) RAGE基因-374位点扩增产物测序图，图中方框内为-374位点的基因型，从左到右依次显示为TA型(A)、AA型(B)、TT型(C)

3 讨论

Klein等[6]对威斯康新州关于DR的影响因素流行病学调查显示，DR的发生与T2DM的病程呈正相关，病程在5 a以内的T2DM患者，其DR的患病率为28.8%，而病程超过15 a者，DR患病率为77.8%。本实验结果也显示，DR患者的病程显著长于NDR组。

DR是T2DM主要的慢性并发症之一，近年来研究发现DR的发生发展不仅与病程、血糖控制不佳有关，还与遗传因素[7]及AGEs-RAGE信号转导途径[8]有关。大量研究发现，无论在T2DM动物模型，还是T2DM患者组织内如视网膜、肾小球系膜等AGEs积聚区域中，RAGE均处于高表达水平[9]。Kaji等[10]将RAGE注射到含RAGE的糖尿病小鼠腹腔内，可阻断RAGE和AGEs的结合，降低血-视网膜屏障破坏，进而改善糖尿病小鼠视网膜病变程度，间接证实了RAGE在DR发生中起着关键作用。综上所述，RAGE基因的表达在 DR病因学中起着重要作用。RAGE作为AGEs发挥病理效应的关键受体，其活性受到多因素的影响，除高血糖以外，RAGE基因变异及表达异常可能也是重要原因。2001年Husdon等[11]首次发现RAGE启动子区存在-374T/A、-429T/C多态，并提出这两位点的多态性能明显增强该基因的转录活性。Abdel-Azeez等[12]研究也证实RAGE启动子区-374T/A的置换可提高一系列转录因子对RAGE基因启动区的亲和力，诱导转录因子结合形成复合体，显著影响其转录活性。

本研究发现，RAGE基因启动子区-374T/A多态性中，DR组AA基因型及A等位基因频率分布显著高于NDR组及对照组，其差异均有统计学意义(P<0.05)；NDR组与对照组的各基因型及等位基因频率分布比较，差异均无统计学意义，从而提示-374位点A等位基因可能是促进DR发生和进展的因子，而并非是导致T2DM发生和发展的因素。通过单因素Logistic回归分析发现，携带A等位基因T2DM人群的DR发病风险是携带T等位基因的1.934倍。因此我们推测:RAGE启动子区-374T/A多态性与无锡地区DR的发生有一定相关性，且A等位基因可能是其危险因素。Lindholm等[3]的研究也证实，-374A等位基因能增加DR发生的风险，与本实验的观点相一致。但与Globocnik等[4]研究结论不同，这可能与研究人群的地域性、种族、样本量以及病程等因素有关。

DR的发生发展受到多种因素的影响，其研究方法仍有一定的局限性，对于RAGE基因启动子区-374T/A多态性与DR的确切关系，还需扩大样本进一步前瞻性研究。以后我们将进一步研究该基因型与RAGE表达之间的关系，为DR临床的早期诊断和基因治疗打下基础。

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3 Lindholm E,Bakhtadze E,Cilio C,Agardh E,Groop L,Agardh CD.Association between LTA,TNF and AGER polymorphisms and late diabetic complications[J].PLoSOne,2008,3(6):e2546.

4 Globocnik PM,Steblovnik K,Peterlin B,Petrovic D.The-429 T/C and-374 T/A gene polymorphisms of the receptor of advanced glycation end products gene are not risk factors for diabetic retinopathy in Caucasians with type 2 diabetes[J].KlinMonblAugenheilkd,2003,220(12):873-876.

5 Ng ZX,Kuppusamy UR,Tajunisah I,Fong KC,Chua KH.Association analysis of-429T/C and-374T/A polymorphisms of receptor of advanced glycation end products(RAGE)gene in Malaysian with type 2 diabetic retinopathy[J].DiabetesResClinPract,2012,95(3):372-377.

6 Klein R,Klein BE,Moss SE,Davis MD,DeMets DL.The Wisconsin epidemiologic study of diabetic retinopathy.II.Prevalence and risk of diabetic retinopathy when age at diagnosis is less than 30 years[J].ArchOphthalmol,1984,102(4):520-526.

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12 Abdel-Azeez HA,El-Okely AM.Association of the receptor for advanced glycation end products(RAGE)-374 T/A gene polymorphism and circulating soluble RAGE with nephropathy in type 1 diabetic patients[J].EgyptJImmunol，2009,16(1):95-106.

date:Jul 25,2013

The Open Project Program of the Jiangsu Key Medical Laboratory(No:WKF0811)From theDepartmentofOphthalmology,WuxiPeople’sHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Wuxi214023，JiangsuProvince，China

Association analysis of advanced glycation end products gene receptor-374T/A polymorphisms in Han people of Wuxi area with type 2 diabetic retinopathy

GU Zhe-Yao,YAO Yong,XIE Tian-Hua,CAO Jia,ZOU Jian

advanced glycation end products receptor;gene polymorphism;diabetic retinopathy

ObjectiveTo investigate the correlation of advanced glycation end products (RAGE) receptor -374T/A gene polymorphism with diabetic retinopathy (DR) in type 2 diabetes mellitus.MethodsThe -374T/A polymorphism of RAGE gene was determined by polymerase chain reaction and direct sequencing in 120 normal control subjects and 185 patients with type 2 diabetes mellitus,including 92 subjects with DR and 93 subjects with NDR ( Non-DR).The frequencies of RAGE genotype,allele and biochemical criterion among those groups were compared.ResultsThe disease course in DR group was significantly longer than that in NDR group(t=2.254,P=0.01),and other biochemical criterion in both groups were not significant different(allP>0.05).In DR,NDR and normal control groups,the AA genotype frequencies were 6.5%,2.2% and 3.3%,respectively.The frequencies of A allele were 23.9%,14.0% and 15.4%,respectively.The DR group were higher than the NDR group and normal control group,there were statistical significant differences (P=0.026,0.015,0.035,0.027).The AA genotype frequencies and A allele frequencies between NDR group and normal control group showed no significant difference (allP>0.05).Single factor Logistic regression analysis showed A allele was associated with DR(OR=1.934,95%CI:1.132-3.303).ConclusionRAGE -374T/A gene polymorphism may be associated with the development of DR and the A allele may be the risk factor in Wuxi area.

顾喆瑶，女，1989年1月出生，江苏人，硕士。主要研究方向为糖尿病视网膜病变。E-mail:1181992191@qq.com

AboutGUZhe-Yao:Female,born in January,1989.Postgraduate student.E-mail:1181992191@qq.com

2013-07-25

江苏省医学重点学科(实验室)开放课题(编号:WKF0811)

214023 江苏省无锡市，南京医科大学附属无锡市人民医院 眼科

姚勇，E-mail:pard1@126.com

顾喆瑶，姚勇，谢田华，曹葭，邹健．无锡地区汉族人群RAGE基因启动子区⁃374T/A多态性与糖尿病视网膜病变的相关研究[J]．眼科新进展，2014，34(7)：655⁃657，661．

10．13389/j．cnki．rao．2014．0179

【应用研究】

修回日期:2014-02-21

本文编辑:董建军

Accepteddate:Feb 21,2014

Responsibleauthor:YAO Yong，E-mail:pard1@126.com

[RecAdvOphthalmol，2014，34(7):655-657，661]