八肽胆囊收缩素及其受体拮抗剂对吗啡戒断大鼠脑内［Ca2+］i和CaM活性的影响

张雅静，马兴友，文 迪，杨胜昌，于 峰，董 玫，马春玲，丛 斌

(1.河北医科大学法医系，河北省法医学重点实验室，河北石家庄 050017;2.石家庄市第一医院肿瘤内科，河北石家庄 050011;3.邢台医学高等专科学校第二附属医院，河北邢台 054000)

八肽胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK-8)是广泛存在于中枢和周围神经系统的一种神经肽，其通过CCK1及CCK2两种不同的受体亚型参与调节疼痛、焦虑、学习和记忆等过程。我室前期研究发现CCK-8对阿片成瘾过程具有明显的调节作用［1］。Ca2+-CaM-CaMK是药物成瘾过程中除AC-PKA之外另一条重要的信号转导通路，在吗啡依赖和戒断过程中起着重要作用［2］。本实验通过建立吗啡戒断大鼠模型，采用流式细胞术检测大鼠皮质、海马和纹状体内［Ca2+］i和CaM活性，探讨CCK-8及其受体拮抗剂参与调节吗啡依赖及戒断过程的细胞信号机制，为CCK-8在戒毒方面的应用提供相关实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂 盐酸吗啡(morphine hydrochloride，Mor)为沈阳第一制药厂产品;CCK-8、纳洛酮(naloxone，Nal)购自美国Sigma公司，CCK1受体拮抗(L-364，718)和 CCK2受体拮抗剂(LY-288，513)购自英国Tocris公司，三氟拉嗪(TFP)购自瑞士A-lexis公司，Fluo3-AM和F-127购自DOJINDO公司;FACS Calibur型流式细胞仪为美国BD公司产品。

1.2 动物分组及给药方式 清洁级健康♂ Wistar大鼠42只，体质量190～210 g，由河北省实验动物中心提供。实验前适应性饲养 1周，室温 (22±1)℃，湿度50%，自然昼夜循环非直接光照条件生活，通风良好，自由摄食、饮水。适应性饲养1周后，参照文献建立大鼠慢性吗啡依赖及急性催促戒断模型:以剂量递增法连续皮下注射吗啡 (10、20、30、40、50 mg·kg－1)5 d，每天 2 次，间隔12 h(8 ∶00、20∶00)，记录每日大鼠体重变化。d 6，8∶00皮下注射吗啡50 mg·kg－1，2 h后腹腔注射盐酸纳络酮(5 mg·kg－1)进行催促戒断，记录戒断后15 min大鼠跳跃次数及1 h后体重变化。然后用改良Gellert-Holtzman法评价模型建立是否成功，剔除未成模动物。具体分组如下，①盐水对照组(Control):背部皮下注射同等剂量的生理盐水;②吗啡依赖组(Mor):按照上述方案进行吗啡皮下注射;③戒断组(Nal):按照上述方案吗啡皮下注射后2 h进行纳络酮催促戒断;④－⑥慢性药物干预组(CCK-8/L-364，718/LY-288，513):给予吗啡前 30 min 分别腹腔注射 CCK-8(50 μg·kg－1)，L-364，718(1 mg·kg－1)，LY-288，513(1 mg·kg－1)，余同③;⑦溶剂对照组(Vehicle):给予吗啡前30 min，注射同等体积的溶剂 (DMSO ∶1，3-丙二醇 =1 ∶4，1 ml·kg－1)，余同③。

1.3 大鼠神经细胞的急性分离 实验结束后大鼠行断头术，取脑放入定位模具内，参照大鼠脑立体定位图谱 (Paxinos and Watson，1998)，冰浴下分离额叶皮质、海马和纹状体，立即置于4℃预冷的含10%胎牛血清的DMEM培养基中。参照文献制备单细胞悬液，方法如下:剔除软脑膜和血管，用无钙镁Hanks液清洗后，将组织充分剪碎，研磨，过200目筛网，再过400目筛网去除团块，将滤液离心(4℃，1 000 r·min－1，10 min)，收集沉淀，用 Hanks液洗涤1次，最后调整细胞浓度到1 ×1010～2×1010个·L－1，用台盼蓝染色鉴定细胞活性，细胞活性大于90%可用于［Ca2+］i及CaM活性的测定。

1.4 细胞内 ［Ca2+］i的测定 取400 μl上述细胞悬液，加入2 μl Fluo-3 AM(终浓度 5 μmol·L－1)和2 μl F-127(终浓度 0.05%)，于 37℃ 恒温箱中负载30～40 min，负载后的细胞用无钙镁液Hanks洗涤2次。每份标本用流式细胞仪测定10 000个细胞的平均荧光强度(average of fluorescent intensity)，以反映［Ca2+］i的变化。

1.5 CaM活性的测定 取400 μl上述细胞悬液，加入1 ml预冷的70%乙醇进行固定，4℃ 过夜。然后用无钙PBS洗涤3次，加入1 mmol·L－1三氟拉嗪2 ml振荡混匀，用250～256 nm紫外光照射20 min。每份标本用流式细胞仪测定10 000个细胞的平均荧光强度，用以反映CaM活性的变化。

1.6 统计学处理 采用 SPSS 10.0数据统计软件处理，以对照组的平均荧光强度为标准，其余各组与之相比，再次计算的比值作为统计值±s，结果行单因数的方差分析(ANOVA)，用最小显著差法(least significant difference，LSD)做两两比较。

2 结果

2.1 CCK-8及其受体拮抗剂对神经细胞内［Ca2+］i的影响 吗啡依赖大鼠在给予纳络酮催促戒断后，观察到齿颤、湿狗样抖动、腹泻、流泪、流涎、跳跃、体重明显下降等戒断症状，说明慢性吗啡依赖和急性催促戒断模型建立成功。慢性吗啡处理后额叶皮质、海马和纹状体神经细胞内［Ca2+］i与对照组比较明显升高(P＜0.01);纳洛酮催促戒断后，大鼠额叶皮质、海马和纹状体神经细胞内［Ca2+］i与吗啡依赖组比较均明显降低(P＜0.01);CCK-8及其受体拮抗剂预处理使吗啡戒断大鼠海马和纹状体神经细胞内［Ca2+］i明显升高(P＜0.05)，而CCK-8及其受体拮抗剂预处理对吗啡戒断大鼠额叶皮质神经细胞内［Ca2+］i无明显影响(P＞0.05);溶剂对照组皮质、海马和纹状体内［Ca2+］i与戒断组相比差异无显著性(P＞0.05)。见Fig 1，Tab 1。

Fig 1 Effect of CCK-8 and its receptor antagonist on intracellular calcium in prefrontal cortex(PFC)，hippocampus(Hip)and cauduate putamen(CPu)of morphine withdrawal rats(±s，n=6)

Tab 1 Effect of CCK-8 and its receptor antagonists on intracellular calcium in cortex，hippocampus and caudate putamen of morphine withdrawal rats(±s，n=6)

Tab 1 Effect of CCK-8 and its receptor antagonists on intracellular calcium in cortex，hippocampus and caudate putamen of morphine withdrawal rats(±s，n=6)

＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs Mor;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs Nal.

Group ［Ca2+］i /%of control PFC Hip CPu Control 1±0 1±0 1±0 Mor 1.282 ±0.109＊＊ 1.704 ±0.101＊＊ 1.697 ±0.171＊＊Nal 1.103 ±0.120## 1.187 ±0.081## 1.293 ±0.045##Vehicle 1.053 ±0.071 1.232 ±0.099 1.327 ±0.086 CCK-8 1.008 ±0.098 1.139 ±0.031△△ 1.441 ±0.017△L-364，718 1.068 ±0.179 1.286 ±0.136△△ 1.447 ±0.013△LY-288，513 1.090 ±0.149 1.474 ±0.189△△ 1.564 ±0.033△△

2.2 CCK-8及其受体拮抗剂对神经细胞内 CaM活性的影响 慢性吗啡处理使大鼠额叶皮质、海马和纹状体神经细胞内 CaM活性明显增强(P＜0.01);而吗啡戒断组大鼠皮质、海马和纹状体神经细胞内CaM活性与吗啡依赖组比较均明显降低(P＜0.01);CCK-8及其受体拮抗剂预处理使吗啡戒断大鼠海马和纹状体神经细胞内CaM活性明显升高(P＜0.05)，而CCK-8及其受体拮抗剂预处理对吗啡戒断大鼠皮质神经细胞内CaM活性无明显影响(P＞0.05);溶剂对照组皮质、海马和纹状体内CaM活性与戒断组相比差异无显著性(P＞0.05)。见 Fig 2，Tab 2。

Fig 2 Effect of CCK-8 and its receptor antagonists on intracellular calmodulin in cortex，hippocampus and caudate putamen of morphine withdrawal rats(±s，n=6)

Tab 2 Effect of CCK-8 and its receptor antagonist on intracellular calmodulin in cortex，hippocampus and caudate putamen of morphine withdrawal rats(±s，n=6)

Tab 2 Effect of CCK-8 and its receptor antagonist on intracellular calmodulin in cortex，hippocampus and caudate putamen of morphine withdrawal rats(±s，n=6)

＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs Mor;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs Nal.

Group CaM/%of control PFC Hip CPu Control 1±0 1±0 1±0 Mor 1.923 ±0.302＊＊ 1.544 ±0.092＊＊ 1.349 ±0.107＊＊Nal 1.153 ±0.051## 0.696 ±0.008## 0.861 ±0.097##Vehicle 1.027 ±0.004 0.632 ±0.029 0.850 ±0.182 CCK-8 1.639 ±0.117△△ 0.887 ±0.044△△ 2.332 ±0.181△△L-364，718 1.393 ±0.031△ 1.043 ±0.114△△ 1.079 ±0.085△△LY-288，513 2.036 ±0.069△△ 1.323 ±0.082△△ 1.594 ±0.189△△

3 讨论

阿片成瘾是一种慢性复发性脑病，其发生的确切机制尚不清楚。最近研究认为，许多非阿片受体作用系统可能是阿片依赖防治中的重要靶点。胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)是一种典型的脑肠肽，并作为神经递质和神经调质在中枢神经系统发挥着重要作用［3－4］。研究发现，在中枢神经系统内源性阿片肽、CCK及其受体重叠分布。CCK-8是目前已知作用最强的内源性“抗阿片肽”，其通过CCK1及CCK2两种不同的受体亚型在疼痛、学习记忆、药物成瘾及情感等方面发挥多重调节作用。以往的研究已证实了CCK在吗啡依赖和戒断中的抗阿片作用［5］，并且发现应用CCK受体拮抗剂能逆转吗啡耐受、减轻吗啡成瘾大鼠的急性催促戒断症状［6］。但是，我们的研究结果还发现慢性吗啡作用后中枢CCK受体系统明显上调［7］，内源性小剂量CCK-8可通过CCK2受体作为一种内源性“抗阿片肽”通过负反馈机制调节吗啡依赖过程;而外源性大剂量CCK-8则可通过激活CCK1受体抑制吗啡精神依赖及复吸过程［8］，抑制吗啡条件性位置厌恶［9］，使内源性阿片肽原PENK、POMC基因表达增加［10］。比较发现，外源性CCK-8的干预剂量要比内源性CCK的剂量高10～1 000倍，我们推断这种现象与CCK-8的效应浓度存在一定关系，但其具体机制尚不明确。

Ca2+-CaM-CaMK是吗啡依赖和戒断过程中一条重要的信号转导通路。Ca2+是细胞内普遍存在的第二信使，与效应器蛋白的结合，操纵不同生理学反应指令的发出，细胞内钙离子在调节细胞功能的不同方面起枢轴作用。研究表明吗啡可通过与其受体结合而改变NG108-15、SH-SY5Y和星形胶质细胞等神经细胞内的 ［Ca2+］i动态平衡［11］。长期应用吗啡将改变中枢和外周钙离子通道的数目和开放状态。使用阿片类细胞内钙离子浓度的增加可能有两条途径:胞外钙离子内流和细胞内钙库释放钙离子。王林等［12］采用激光共聚焦显微镜观察发现吗啡成瘾大鼠相关核团神经细胞内［Ca2+］i明显升高。钙调蛋白(calmodulin，CaM)是胞内一个重要的信号转导分子，在一定量的［Ca2+］i存在的情况下，CaM从胞质的游离状态转至结合状态而呈出活性。本实验显示，吗啡依赖大鼠皮质、海马和纹状体神经细胞内［Ca2+］i和 CaM的活性明显增加;而纳洛酮催促戒断则使Ca2+和CaM活性明显下降，其结果与文献报道结果一致。溶剂组大鼠皮质、纹状体和海马神经细胞内［Ca2+］i和 CaM活性变化同戒断组相比无明显变化，这说明每日给予溶剂对神经细胞内的钙离子浓度变化无影响，从而排除了拮抗剂处理组神经细胞内引起［Ca2+］i和 CaM 活性变化由溶剂引起的可能。

CCK-8干预可以翻转纳洛酮戒断引起的海马和纹状体内［Ca2+］i和 CaM活性的降低，但对皮质内［Ca2+］i和CaM活性的降低无明显影响。该结果表明，［Ca2+］i和CaM 活性的变化在吗啡依赖和戒断过程中起着重要的作用，CCK-8可以通过增加脑内［Ca2+］i和CaM的活性等作用达到缓解部分戒断症状的作用。其机制可能是(1)CCK-8通过激活胞内第二信使 IP3而引起细胞内钙库释放，从而使［Ca2+］i的增加。(2)CCK-8也可能是通过激活DAG-PKC途径，加速细胞外钙的内流，从而使［Ca2+］i增加。不同脑区在吗啡成瘾过程中的作用不同，CCK-8其在不同部位可能发挥不同的作用，从而表现出CCK-8作用的脑区特异性。我们在前期研究中发现不同浓度的CCK-8可分别通过激活CCK1/2受体在吗啡依赖过程中发挥不同作用。由于细胞表面两种受体亚型(CCK1R和CCK2R)的敏感度及其偶联Gs/i蛋白的功能不一致，并且 CCK2受体还可能通过Gs或Gi蛋白以及不同的信号通路介导多种生物学功能。总结本文的实验结果，CCK及其受体拮抗剂翻转纳洛酮催促戒断引起［Ca2+］i和CaM活性的降低，可能是其对抗吗啡成瘾的机制之一。不同剂量的CCK-8对吗啡成瘾动物的影响及其受体及受体后信号机制还有待进一步研究。

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