晚期糖基化终产物诱导人主动脉内皮细胞氧化应激损伤及线粒体功能紊乱

丁银慧，孙竞，钱元霞，李芸子，高静，陈赟

（1.江苏大学药学院，江苏镇江212013；2.南京大学医学院附属鼓楼医院泌尿外科，江苏南京210008）

晚期糖基化终产物诱导人主动脉内皮细胞氧化应激损伤及线粒体功能紊乱

丁银慧1，孙竞1，钱元霞1，李芸子1，高静1，陈赟2

（1.江苏大学药学院，江苏镇江212013；2.南京大学医学院附属鼓楼医院泌尿外科，江苏南京210008）

目的：观察晚期糖基化终产物（advanced glycation end products，AGEs）对内皮细胞氧化应激水平和线粒体功能的影响，以探讨糖尿病血管内皮细胞功能障碍可能的发生机制。方法：以不同质量浓度（50，100μg／mL）的AGE修饰的牛血清白蛋白（AGE-bovine serum albumin，AGE-BSA）作用于人主动脉内皮细胞（human aortic endothelial cells，HAECs）48 h，CCK-8法测定HAECs的增殖能力，黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力，应用DCFH-DA探针检测细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平；JC-1法检测线粒体膜电位（mitochondrialmembrane potential，MMP），荧光素荧光素酶法和Clark氧电极法测定细胞中ATP含量及细胞耗氧率。结果：AGE-BSA能显著性地抑制HAECs增殖，增加细胞内ROS水平，降低SOD活力，且高质量浓度作用更加明显。同时，AGE-BSA还能使MMP下降、ATP生成及耗氧减少。结论：AGE-BSA诱导HAECs产生氧化应激损伤，其机制与其造成线粒体功能紊乱相关。

晚期糖基化终产物；氧化应激；线粒体；人主动脉内皮细胞

糖尿病是威胁人类健康的主要疾病之一，其慢性并发症可涉及全身所有组织和器官，其中血管（包括大血管和微血管）病变和神经病变表现最为明显和突出。研究显示，糖尿病患者体内存在的氧化应激状态使其发生血管病变的概率大大提高，高血糖可促使内皮细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生增加而导致最后的功能障碍，而内皮功能障碍是糖尿病血管病变发生的始动环节。近来晚期糖基化终产物（advanced glycation end products，AGEs）在多种糖尿病并发症中的病理生物学作用已成为研究的热点，AGEs的蓄积被认为是糖尿病患者发生内皮功能障碍的原因之一。研究表明，糖尿病患者血浆中AGEs蓄积水平明显增高，且随着病程的延长AGEs浓度也逐渐增加［1］，其通过促进ROS的生成、基底膜与胞质交流及通过与AGEs受体（RAGE）的作用调节各种细胞信号传导，加快糖尿病患者微血管和大血管的损伤［2－4］。线粒体是真核细胞中重要的细胞器之一，是细胞的“能量工厂”。此外，线粒体也是内源性ROS的主要来源，电子传递过程中有2%的O2和漏电子相结合，形成氧自由基，而线粒体又对氧化应激有高敏感性，可造成线粒体DNA的不稳定和突变，最终造成能量调节过程受损［5］。在糖尿病进程中，线粒体产生了过多的ROS，使细胞处于氧化应激状态。

本研究以人主动脉内皮细胞（human aortic endothelial cells，HAECs）为研究对象，观察AGEs对血管内皮细胞氧化应激水平和线粒体功能的影响，探讨糖尿病血管内皮功能障碍可能的机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

Heraeus CO2孵箱；Nikon eclipse TS100倒置式显微镜；Nikon Ti-E活细胞荧光工作站；SpectraMax 190酶标仪；Spectra MaxGemini荧光酶标仪；化学发光酶标仪；Oxygrtherm Clark氧电极。

AGE修饰的牛血清白蛋白（AGE-BSA）（美国Biovision公司）；F12培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；0.25%胰酶（美国Amresco公司）；CCK-8试剂及ATP检测试剂盒、DCFH-DA活性氧检测试剂盒（南通碧云天生物技术有限公司）；JC-1（美国Molecular Probes公司）；总超氧化物歧化酶（T-SOD）测试盒及考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒（南京建成生物工程研究所）；其余未特殊注明的试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞株及培养

HAECs（由南京鼓楼医院周六化老师惠赠）用含10%胎牛血清F12培养基在37℃、5%CO2及饱和湿度的孵箱中培养。

1.3 CCK-8法检测细胞活力

取对数生长期HAECs，消化、计数，以3×104个／mL的密度接种于96孔培养板中，每孔100μL。培养24 h后加入不同质量浓度的AGE-BSA（50，100 μg／mL），对照组加入等体积的含10%胎牛血清DMEM，作用48 h后，每孔加入10μL CCK-8，继续培养2 h，用酶标仪在450 nm处测定光密度（D）值。

1.4 细胞中SOD活力的测定

细胞中SOD活力的测定，严格按照SOD测定试剂盒说明书进行。

1.5 DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平

各组按要求处理结束后吸去培养基，PBS洗1次，加入无血清培养基稀释的DCFH-DA溶液，使其终浓度为10μmol／L，37℃孵育30 min，然后PBS洗2次，在荧光显微镜下观察或使用荧光酶标仪检测荧光强度。

1.6 JC-1染色检测线粒体膜电位

各组按要求处理结束后吸去培养基，加入5μg／mL的JC-1，37℃孵育30 min，然后PBS洗2次，在荧光显微镜下观察或使用荧光酶标仪检测荧光强度。

1.7 荧光素荧光素酶法检测ATP的生成

用6孔板接种HAECs，各组按要求处理结束后吸去培养基，用PBS洗2次，经ATP裂解液裂解，4℃12 000×g离心10 min，取上清。取96孔化学发光专用培养板，每孔加入100μL ATP检测试剂，反应2 min，扣除本底后每孔加入相同体积的样本，用化学发光酶标仪检测荧光强度，计算样本中ATP的浓度。将样本进行蛋白含量测定，计算每毫克蛋白ATP的量。

1.8 Clark氧电极法检测细胞耗氧率

用6孔板接种HAECs，各组按要求处理结束后吸去培养基，收集细胞于离心管中，用氧电极检测每组细胞的耗氧率［nmol／（min·mL）］。最后对每组细胞计数，根据耗氧率及细胞密度计算每组细胞的耗氧率［nmol O2／（min·104细胞）］。

1.9 统计方法

2 结果

2.1 AGE-BSA对HAECs细胞增殖活性的影响

与对照组相比，50μg／mL和100μg／mL的AGE-BSA能显著降低细胞活性（P＜0.05），且AGE-BSA高浓度组较低浓度组细胞活性也有显著下降（P＜0.05），随着AGE-BSA浓度增加细胞增殖活性不断下降（图1）。形态学观察结果显示，随着AGE-BSA浓度的增加，AGE-BSA处理组细胞数目减少，胞体形态不如对照组饱满，且变圆脱壁的细胞也有所增加（图2）。

图1 AGE-BSA对HAECs增殖活性的影响

图2 AGE-BSA对HAECs形态的影响（200×）

2.2 AGE-BSA对HAECs中SOD活力的影响

SOD活力测定结果表明，与对照组相比，AGEBSA处理组的SOD活力显著下降（P＜0.05），且AGE-BSA高浓度组较低浓度组SOD活力也有显著下降（P＜0.05）（图3）。

图3 AGE-BSA诱导HAECs中SOD活力下降

2.3 AGE-BSA对HAECs中ROS水平的影响

DCFH-DA荧光探针检测结果表明，与对照组相比，AGE-BSA（50，100μg／mL）作用于HAECs时，细胞中ROS含量显著增加（P＜0.05）（图4）；如图5所示，与对照组相比，AGE-BSA处理组的细胞中绿色荧光明显较强，与定量结果相一致。

图4 AGE-BSA对HAECs中ROS含量的影响

图5 DCFH-DA染色后拍摄荧光照片（400×）

2.4 AGE-BSA对HAECs线粒体功能的影响

2.4.1 AGE-BSA对线粒体膜电位的影响 JC-1染色检测线粒体膜电位结果表明，与对照组相比，50 μg／mL和100μg／mL AGE-BSA能显著降低细胞中线粒体膜电位（P＜0.05）（图6）；如图7所示，AGE-BSA组的线粒体膜电位明显低于对照组，表明AGE-BSA作用后线粒体膜电位降低，与定量结果相一致。

图6 AGE-BSA诱导HAECs中JC-1的红／绿荧光比值下降

图7 JC-1染色后拍摄荧光照片（200×）

2.4.2 AGE-BSA对ATP含量及耗氧率的影响 荧光素 荧光素酶法检测ATP含量结果显示，与对照组相比，AGE-BSA能显著降低细胞ATP水平（P＜0.05），且100μg／mL AGE-BSA组较50μg／mL AGE-BSA组ATP水平有显著下降（P＜0.05）（图8）。测定耗氧率结果表明，与对照组相比，50μg／mL和100μg／mL AGE-BSA均显著降低细胞的耗氧率（P＜0.05），且随着AGE-BSA质量浓度的增高，细胞耗氧率呈不断下降的趋势（P＜0.05）（图9）。

图8 AGE-BSA诱导HAECs中ATP水平下降

图9 AGE-BSA诱导HAECs耗氧率下降

3 讨论

糖尿病血管内皮功能障碍是糖尿病血管病变发生的始动环节，大量研究表明，AGEs与RAGE的相互作用在糖尿病血管内皮功能障碍中发挥着重要作用。但AGEs引起血管内皮细胞功能紊乱的机制仍不甚完善。有文献报道AGEs能引起胰岛β细胞氧化应激损伤，同时能降低细胞抗氧化能力［6－7］；另有文献报道AGEs也能导致内皮细胞中ROS的升高从而导致功能障碍［8－10］；本实验室前期研究也发现，动脉粥样硬化大鼠血管发生重构，总SOD和Mn-SOD活力下降［11］。本实验结果表明AGE-BSA可以引起HAECs增殖活性下降，并且使得SOD活力下降及ROS水平的升高，与既往研究结果相一致。研究发现氧化应激已成为糖尿病并发症发生和发展的一个重要的致病因子［12－13］。大量动物实验表明通过添加抗氧化剂或过表达SOD或过氧化氢酶能够预防组织细胞的病变，间接证明了ROS在糖尿病并发症的发生中起着重要作用［14－16］。而线粒体是ROS的主要来源，当内皮细胞线粒体电子传递链被中断时，高糖诱导内皮细胞ROS增加受阻［17］。Giacco等［13］研究认为高糖诱导超氧化物产生，随后刺激其他途径产生更多超氧化物发挥更强的损伤作用，同时线粒体功能也不断受损，使机体陷入氧化损伤的漩涡中，在这整个过程中线粒体都是必不可少的。本实验结果表明AGE-BSA能够使HAECs线粒体的膜电位及细胞耗氧能力下降，也使得ATP产生明显减少，说明AGE-BSA作用能够使线粒体功能发生紊乱。由于线粒体膜电位的降低是细胞发生凋亡的标志事件［18］，一旦线粒体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转，因此，推断AGE-BSA可能通过线粒体途径引起内皮细胞凋亡，具体机制还需要作进一步研究。有文献提出，氧化损伤、ATP合成缺陷和钙离子失调往往一起发生，并且其中某一种情况的出现都会导致其他两种情况的发生，然后形成一个恶性循环，最后通过诱导线粒体通透性孔道的开放，导致线粒体的失能［19］。本实验的结果说明AGE-BSA使HAECs发生氧化应激损伤，导致线粒体功能紊乱，最终导致内皮功能障碍。综上所述，AGE-BSA能够使HAECs产生氧化应激损伤，并使得HAECs线粒体功能受损，说明AGE-BSA损伤细胞过程中线粒体起着重要作用，提示通过保护线粒体对抗高血糖引起的内皮细胞损伤可能是治疗糖尿病血管内皮细胞功能障碍的有效手段。

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Advanced glycation end products induce oxidative stress and m itochondrial dysfunction in human aortic endothelial cells

DING Yin-hui1，SUN Jing1，QIAN Yuan-xia1，LIYun-zi1，GAO Jing1，CHEN Yun2
（1.School of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2.Department of Urology，Affiliated Drum Tower Hospital，School of Medicine，Nanjing University，Nanjing Jiangsu 210008，China）

Objective：To investigate whether advanced glycation end products（AGEs）can induce cell injury and mitochondrial dysfunction in human aortic endothelial cells（HAECs）.M ethods：HAECs were treated with increasing concentrations（50，100μg／mL）of AGE-bovine serum albumin（AGE-BSA）for 48 h.The proliferative inhibition of HAECswasmeasured by CCK-8 method.Contents of ATP and activity of superoxide dismutase（SOD）were determined by the luciferase assay and SOD kits.Reactive oxygen species（ROS）were determined by DCFH-DA staining.Mitochondrial membrane potential（MMP）was observed with JC-1 staining.Oxygen utilization wasmeasured polarographically with a Clark oxygen electrode.Results：Compared with control group，AGE-BSA（50，100μg／mL）significantly reduced HAECs proliferation.AGE-BSA significantly increased the levels of ROS，while decreased the activity of SOD compared to the control group.Importantly，AGE-BSA-mediated oxidative stresswas followed by a collapse ofmitochondrialmembrane potential（MMP），the inhibition of ATP generation，and the down-regulation of oxygen utilization.Conclusion：AGE-BSA induced oxidative stress in HAECs.Moreover，AGE-BSA-induced HAECs injury was related tomitochondrial dysfunction.

advanced glycation end products（AGEs）；oxidative stress；mitochondria；human aortic endothelial cells

丁银慧（1989—），女，硕士研究生；孙竞（共同第一作者），男，博士，E-mail：sjyancheng＠aliyun.com；陈赟（通讯作者），主任医师，博士，E-mail：chenyunnju＠hotmail.com；高静（共同通讯作者），教授，博士生导师，E-mail：jinggao＠ujs.edu.cn

R365.587

A

1671－7783（2014）03－0185－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y140004

国家自然科学基金资助项目（81270694）

2014－01－16 ［编辑］ 何承志