siRNA抑制FANCF基因增加肺癌细胞对顺铂的敏感性

陈玉娇，李坚，姜贺果，陈永昌

（1.江苏大学附属医院呼吸内科，江苏镇江212001；2.江苏大学基础医学研究所，江苏镇江212013）

siRNA抑制FANCF基因增加肺癌细胞对顺铂的敏感性

陈玉娇1，李坚1，姜贺果1，陈永昌2

（1.江苏大学附属医院呼吸内科，江苏镇江212001；2.江苏大学基础医学研究所，江苏镇江212013）

目的：研究抑制FA／BRCA途径中的范可尼贫血相关蛋白F（FANCF）基因在增加人肺腺癌CALU-1细胞株对顺铂敏感性中的作用。方法：设计靶向于FANCF基因的3条siRNAs（FANCF-siRNAs），用脂质体转染试剂将其分别转染于CALU-1肺癌细胞株，RT-PCR检测转染后24 h FANCFmRNA的变化；筛选转染效率最高的siRNA片段。蛋白质印迹法检测经顺铂处理的CALU-1细胞株转染siRNA前后FANCF蛋白表达及FANCD2蛋白单泛素化水平；免疫荧光法测定胞核中FANCD2蛋白核聚小体的形成；CCK-8法测定转染siRNA前后的细胞增殖率变化。结果：与转染前比较，CALU-1肺癌细胞株转染FANCF-siRNA后FANCF蛋白表达明显下降，FANCD2蛋白单泛素化水平和核聚小体形成降低，细胞增殖率显著下降。结论：应用siRNA转染技术沉默FANCF基因可明显增加肺癌细胞对顺铂的敏感性，提示在肺癌靶向治疗策略中，FA／BRCA途径中的FANCF基因很可能是一个潜在的分子靶标。

范可尼贫血相关蛋白F；FA／BRCA途径；siRNA；顺铂；敏感性

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率呈逐年增长的趋势。其中，非小细胞肺癌约占80%，主要为肺腺癌与肺鳞癌。顺铂（DDP）作为肺癌治疗方案中的基本化疗药物，属于广谱细胞周期非特异性抗癌药物，但其日益增强的肿瘤耐药性限制了临床应用。研究表明，DNA损伤修复能力是肿瘤细胞对DDP耐药的重要分子基础，通过沉默与DDP耐药相关的基因进而抑制肿瘤细胞的DNA损伤修复能力，可增加肿瘤细胞对DDP的敏感性，逆转耐药状态，从而提高肺癌化疗效果，改善患者预后［1］。

近来的研究显示，范可尼贫血症（Fanconi anemia，FA）途径在DNA交联损伤的修复中发挥重要作用［2］。FA途径受损可导致细胞染色体不稳定及对DNA损伤剂高度敏感。研究表明FA／BRCA途径是细胞对DNA交联剂引起的DNA交联性损伤发生修复反应所必需的。FA途径的核心蛋白是范可尼贫血相关蛋白D2（Fanconi anemia complementation group D2，FANCD2），上游是FA核心复合体，后者主要功能是单泛素化FANCD2，这一过程是BRCA1依赖性的，因此该途径被称为FA／BRCA途径［3－4］。FANCD2在正常人体细胞中表现为两个亚型：FANCD2-S和FANCD2-L。DNA交联剂类化疗药物、紫外线和电离辐射可以激活FANCD2蛋白从相对分子质量为155 000的小片段（FANCD2-S）修饰为162 000的大片段（FANCD2-L），二者之比（L／S）反映FANCD2蛋白单泛素化水平［3］。FA／BRCA途径的信号传导中最关键事件是FANCD2的单泛素化，而范可尼贫血相关蛋白F（FANCF）是FA核心复合体的主要组成成分，在FANCD2的单泛素化过程中发挥着重要作用。FANCF蛋白低表达或功能缺陷会干扰FA／BRCA途径的正常功能，进而参与肿瘤发生、发展及对交联剂类化疗药耐药性的形成。对卵巢癌、宫颈癌及神经胶质瘤的研究发现，部分肿瘤细胞FANCF基因启动子甲基化所致的FANCF蛋白低表达可引起FANCD2单泛素化水平降低、FA／BRCA途径功能被抑制，表现为肿瘤细胞对交联剂类化疗药的敏感性增加［5－7］。抑制FANCF基因表达是否可增加肺癌细胞对DDP的敏感性，尚未见相关报道。

本实验采用siRNA转染技术观察FANCF基因沉默对肺癌CALU-1细胞部分生物学特性的影响。通过比较siRNA转染前后CALU-1细胞的FANCD2单泛素化水平和FANCD2核聚小体形成状态，以及细胞增殖率变化，探讨通过沉默FANCF基因而下调FA／BRCA途径功能，以增加肺癌CALU-1细胞株对DDP敏感性的可行性及效应。

1 材料与方法

1.1 材料

非小细胞肺癌细胞株（CALU-1）购自中国科学院上海生命科学研究院；DDP购自江苏豪森制药有限公司；胎牛血清、高糖DMEM购自美国Gibco公司；siRNA套装购自广州锐博生物科技有限公司；LipofectamineTM2000试剂盒，Trizol购自美国Invitrogen公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；二甲基亚砜，Triton X-100购自美国Sigma公司；β-肌动蛋白，FANCF蛋白抗体，FANCD2蛋白抗体购自美国Santa Cruz公司；低聚甲醛，羊抗小鼠二抗，CY3荧光标记羊抗鼠二抗购自北京康为世纪公司；ECL发光剂购自美国Millipore公司；PVDF膜，牛血清白蛋白（BSA）购自瑞士Roche公司；DAPI购自美国Beyotime公司；反转录试剂盒购自美国Fermentas公司；荧光定量试剂盒购自日本Toyobo公司。

靶向于FANCF基因的3条siRNAs序列（FANCF-siRNAs）由广州锐博生物科技有限公司设计合成。siRNA-1序列：上游，5′-GGUCAACGUUUGCACUAUGDTDT-3′，下游，5′-CAUAGUGCAAACGUUGACCTDTD-3′；siRNA-2序列：上游，5′-GUACCUGGUCUUAGCAUCUDTDT-3′，下游，5′-AGAUGCUAAGACCAGGUACTDTD-3′；siRNA-3序列，上游，5′-CUUCGUAGUG GUGCAUUUADTDT-3′，下游，5′-UAAA UGCACCACUACGAAGTDTD-3′。

引物由上海生工生物工程有限公司设计合成。GAPDH引物序列：上游，5-TCCAAAATCAAGTGGGGCGA-3′，下游，5′-TGATGACCCTTTTGGCTCC-3′；FANCF基因引物序列：上游，5′-TGCTAACAGACTGGGGTCAAC-3′，下游，5′-TACAGGTCTCCAGGGCAGTTA-3′。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 CALU-1细胞株置于含10%热灭活胎牛血清、青霉素（100 U／mL）、链霉素（100 μg／mL）的DMEM中，于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中孵育。

1.2.2 筛选转染效率最高的siRNA片段 将对数生长期的CALU-1细胞接种于6孔板，1×106／孔。培养12 h后换用无血清培养基饥饿12 h。实验分6组，分别为空白对照组、阴性对照siRNA组、阳性对照siRNA组（GAPDH-siRNA），以及3个实验组（分别为siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组）。siRNA转染浓度为50 nmol／L。按照siRNA试剂盒说明书，将LipofectamineTM2000与FANCF-siRNA储存液各5 μL分别溶于250μL不含抗生素的无血清DMEM中，室温孵育5 min。轻摇混匀LipofectamineTM2000与siRNA储存液，室温孵育20 min后，加入培养板中，培养基终体积为2 mL。转染6 h后，换用含10%胎牛血清的DMEM继续培养。转染24 h后行RT-PCR检测各组细胞FANCF mRNA水平，实验重复3次。

1.2.3 蛋白质印迹法检测肺癌细胞FANCF和FANCD2蛋白表达 在3个实验组中选择转染效率最高的siRNA-2片段转染肺癌CALU-1细胞株，取对数生长期转染成功前、后的CALU-1细胞接种于6孔板，2.5×106／孔，培养24 h。经含DDP质量浓度分别为0、2.5、5、10、20μg／mL的2 mL培养基处理24 h，弃培养基，预冷PBS洗2次，加入煮沸的2× SDS上样缓冲液100μL，收集细胞总裂解物，100℃煮沸5 min，超声破碎1 min，12 000×g，4℃离心5 min。将蛋白样品行8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，转印至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h。一抗鼠抗人FANCF单克隆抗体（1∶100）、鼠抗人FANCD2单克隆抗体（1∶200）4℃孵育过夜。二抗羊抗鼠IgG（1∶2 000）室温孵育1 h，β-肌动蛋白（1∶10 000）室温孵育1 h。ECL发光剂显色，Typhoon分子成像系统分析灰度，以FANCF／β-肌动蛋白、FANCD2／β-肌动蛋白比值表示FANCD2蛋白的相对含量，L／S比值反映FANCD2蛋白单泛素化水平，实验重复3次。

1.2.4 免疫荧光法检测FANCD2核聚小体表达在3个实验组中选择转染效率最高的siRNA-2片段转染肺癌CALU-1细胞株，取对数生长期转染成功前、后的CALU-1细胞接种于24孔板，5×105／孔。设空白培养组，每组3个复孔，培养24 h，5μg／mL DDP处理24 h，PBS洗2次；每孔200μL 4%低聚甲醛固定细胞20 min，PBS洗30 min；300μL 0.3% Triton X-100透膜作用40 min，PBS洗30 min；500 μL 3%BSA室温孵育1 h，PBS洗30 min；200μL FANCD2一抗4℃过夜，PBS洗15 min；荧光二抗室温避光孵育1 h，PBS避光洗15 min；DAPI染核10 min，PBS暗处洗15 min；荧光显微镜下观察荧光强度，实验重复3次。

1.2.5 CCK-8法测定细胞增殖率 在3个实验组中选择转染效率最高的siRNA-2片段转染CALU-1细胞株，取对数生长期转染成功前后的CALU-1细胞接种于96孔板中，2.0×103／孔，培养24 h，将一系列含DDP质量浓度分别为0、1.25、2.5、5、10、20 μg／mL的培养基100μL分别加入对应的孔，其中0 μg／mL为阴性对照组，同时设立空白孔（只含培养基）进行校正，每组样本6个复孔。分别培养24、48 h后，于对应孔加入CCK-8试剂10μL，继续培养1 h。酶标仪450 nm波长下检测各孔的光密度（D）值。细胞增殖率＝［（D实验组－D空白孔）／（D阴性对照组－D空白孔）×100%，实验重复3次。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 筛选沉默效率最高的siRNA片段

空白对照组、阴性对照siRNA组、阳性对照siRNA组、siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组的FANCF mRNA表达水平分别为1.09±0.04、1.15±0.07、2.67±0.19、0.98±0.06、0.54±0.04和1.02± 0.05，结果显示干扰效率最高的为实验组中siRNA-2序列（F＝58.248，P＜0.05），其siRNA转染后的细胞基因沉默率约达50.5%。见图1。选择转染效率最高的siRNA-2进行下一步实验。

图1 siRNAs转染CALU-1细胞后电泳结果

2.2 FANCF-siRNA转染前后肺癌细胞FANCF蛋白表达及FANCD2单泛素化水平

经FANCF-siRNA转染后CALU-1细胞的FANCF蛋白较阴性对照组及空白对照组明显减少（t分别为－5.487，－6.251，P均＜0.05），而阴性对照组与空白对照组比较，差异无统计学意义（t＝ 0.081，P＞0.05），表明FANCF-siRNA转染有效。见图2。

经FANCF-siRNA转染的CALU-1细胞，除20 μg／mL DDP处理24 h后的L／S比值与转染前差异无统计学意义外，其余各质量浓度处理24 h后的FANCD2蛋白总量及L／S比值均较转染前明显降低（P均＜0.05），表明FANCD2单泛素化水平显著降低。见图3。

2.3 FANCF-siRNA转染前后肺癌细胞FANCD2核聚小体表达

免疫荧光检测结果显示，CALU-1细胞经5μg／mL DDP处理24 h和48 h后，胞核内FANCD2核聚小体表达增强（核聚小体形成）；CALU-1细胞转染FANCD2-siRNA后，经5μg／mL DDP处理24 h后胞核内FANCD2核聚小体表达降低。见图4。

图2 FANCF-siRNA转染前后CALU-1细胞株FANCF蛋白表达

图3 FANCF-siRNA转染前后CALU-1细胞株FANCD2单泛素化水平（L／S比值）

图4 FANCD2核聚小体（箭头示）表达情况

2.4 转染FANCF-siRNA后顺铂对CALU-1细胞株增殖的抑制作用

CALU-1细胞株转染FANCF-siRNA 24 h和48 h后，IC50较转染前均显著降低（P均＜0.05）。见表1。

转染FANCF-siRNA前后的CALU-1株细胞增殖率均随DDP质量浓度的增高而降低，呈剂量依赖性，每个时间点不同浓度组之间增殖率差异均有统计学意义（P均＜0.05）。FANCF-siRNA转染后，CALU-1株细胞增殖率在顺铂处理24 h和48 h时间点低于其siRNA转染前（P均＜0.05）。见图5。

表1 siRNA转染前后CALU-1肺癌细胞经顺铂处理后的IC50 μg／m L

3 讨论

FA／BRCA途径主要在细胞周期的S期被激活，在交联剂类化疗药物（如DDP）引起细胞DNA损伤的修复过程中发挥重要作用。激活初始是FA／BRCA途径上游蛋白（如FANCA、FANCB、FANCC、FANCE、FANCF等）形成FA核心复合体，然后FANCD2与FANCDI在FA核心复合体及泛素化结合酶（E2）等蛋白的作用下发生单泛素化，形成复合物ID，并与BRCA1，BRCA2，RAD51及ATR等相互作用，在DNA损伤部位共定位形成核聚小体，进而激活FA／BRCA途径下游蛋白，与其他DNA修复途径（如同源重组修复途径、核苷酸切除修复途径）相互作用，从而启动对细胞DNA交联性损伤的修复并对DDP等交联剂产生抵抗［8－11］。研究发现，在头颈部癌细胞中，DDP敏感细胞株FANCD2单泛素化水平明显降低，而DDP耐药细胞株FANCD2泛素化水平正常，抑制FA／BRCA途径上游蛋白从而下调FANCD2单泛素化水平可显著增强头颈部癌细胞对DDP、奥沙利铂的敏感性［12－13］。应用选择性FA／BRCA途径抑制剂（如姜黄素等）在体外分别处理宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、乳腺癌细胞和骨髓瘤细胞，可明显增强其对DNA交联剂类抗癌药物的敏感性［14－16］，说明完整的FA／BRCA途径功能状态在肿瘤细胞对DNA交联剂类抗癌药物的耐药机制中起重要作用，损害或抑制FA／BRCA途径功能可增强肿瘤细胞对DNA交联剂类抗癌药物的敏感性。

图5 FANCF-siRNA转染CALU-1细胞增殖率的剂量 效应曲线与时间 效应曲线

FANCF作为FA／BRCA途径的重要调控蛋白，位于该途径上游，通过N端与FANCC／FANCE亚单位相互作用，通过C端与FANCF／FANCG亚单位相互作用，发挥稳定FA复合体的作用。FANCD2在 FA复合体的作用下发生单泛素化，这是FA／BRCA途径信号传导过程中最关键的事件，而FANCF是激活FANCD2单泛素化的关键因子，因此，FANCF是FA／BRCA途径生物学功能所必需的重要蛋白。FANCF基因表达下降或缺失会导致FA／BRCA信号转导途径缺陷、细胞染色体不稳定以及对DNA交联性损伤剂高度敏感［17－19］。He等［6］研究显示，采用siRNA技术沉默卵巢癌OVCAR3细胞的FANCF基因可降低FANCF、FANCD2蛋白的表达和FANCD2单泛素化水平，增加OVCAR3细胞对阿霉素的敏感性，表明沉默FANCF基因能抑制卵巢癌OVCAR3细胞的FA／BRCA途径功能从而逆转细胞对阿霉素的耐药性。Li等［7］研究也显示沉默乳腺癌MCF-7细胞的FANCF基因可降低FANCD2单泛素化水平，抑制乳腺癌MCF-7细胞的FA／BRCA途径功能从而增加其对米托蒽醌（mitoxantrone）的敏感性。

本实验室之前的研究已经证明肺癌细胞株CALU-1对DDP的耐药性明显高于肺癌A549细胞［20］，故本实验选择对DDP耐药性较高的CALU-1细胞，采用siRNA转染技术沉默FANCF基因，通过观察FANCF基因沉默前后FANCD2单泛素化水平和FNACD2核聚小体形成状态，以及细胞增殖率变化，探讨应用转染技术沉默FANCF基因，抑制FA核心复合体形成后增加肺癌细胞株CALU-1对顺铂敏感性的可行性及效应。结果显示，转染FANCF-siRNA的CALU-1细胞，经DDP处理后，FANCF蛋白表达明显下降，证实转染成功，FANCD2单泛素化水平及FANCD2核聚小体表达均降低，反映FA／BRCA途径上游蛋白被激活并已行使单泛素化功能，CALU-1细胞的IC50及细胞增殖率显著降低，表明对DDP敏感性明显增强。最终证明，应用siRNA转染技术抑制FA／BRCA途径上游的FANCF基因可显著增加肿瘤细胞对DDP的敏感性。

综上所述，FANCF基因沉默能够抑制肺癌CALU-1细胞株FA／BRCA途径的DNA修复功能，逆转CALU-1细胞株对DDP的耐药性。FANCF有可能成为肺癌分子靶向治疗策略中增强肺癌细胞对交联剂类抗癌药物敏感性的新靶点。

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Silencing of FANCF gene by siRNA interference sensitizes lung cancer CALU-1 cells to cisplatin

CHEN Yu-jiao1，LIJian1，JIANG He-guo1，CHEN Yong-chang2
（1.Departmentof Pulmonary Medicine，Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；2.Institute of BasalMedicine Science，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To examine whether silencing of FANCF gene by siRNA interference technique could sensitize lung adenocarcinoma CALU-1 cell line to cisplatin（DDP）.M ethods：Three siRNAs targeted to FANCF（FANCF-siRNAs）were designed and synthesized.After separately transfected into CALU-1 cells，the RT-PCR was used to determine the expression of FANCF mRNA，the siRNA with the highest transfection efficiency was selected.Western Blotting was carried out to detect the expression of FANCF protein，and the levels of FANCD2 protein monoubiquitination，which was defined by the radio ofmonoubiquitination-FANCD2（L）and non-monoubiquitination-FANCD2（S），in CALU-1 cells treated with cisplatin before and after FANCF-siRNA transfection.Immunofluorescence assay was performed to determine the formation of FANCD2 nuclear foci.CCK-8 technique was used to measure the cell proliferation rate of CALU-1 cells treated with DDP pre-and post-transfection of FANCF-siRNA.Results：After transfection of FANCF-siRNA，we found that silencing of FANCF gene decreased the levels of FANCD2 monoubiquitination（L／S ratio），and nuclear foci formation of FANCD2 in CALU-1 cells.Meanwhile，silencing of FANCF gene significantly decreased the cell proliferation rate in CALU-1 cells treated with DDP（both P＜0.05）.Conclusion：Silencing of FANCF gene by FANCF-siRNA transfection could potentiate the sensitivity to cisplatin in CALU-1 cells，suggesting that FANCF genemay be a potential target in therapeutic strategies for the treatment of lung cancer.

FANCF；FA／BRCA pathway；siRNA；cisplatin；sensitivity

陈玉娇（1987—），女，硕士研究生；李坚（通讯作者），教授，主任医师，博士生导师，E-mail：lijian541226＠163.com

R392.28；R979.1

A

1671－7783（2014）03－0195－06

10.13312／j.issn.1671-7783.y140014

2014－01－24 ［编辑］ 刘星星