小鼠血管平滑肌细胞原代培养及体外钙化模型的制备

徐丽华，严金川，伍超，逯朝阳，王中群，袁伟

（江苏大学附属医院心内科，江苏镇江212001）

小鼠血管平滑肌细胞原代培养及体外钙化模型的制备

徐丽华，严金川，伍超，逯朝阳，王中群，袁伟

（江苏大学附属医院心内科，江苏镇江212001）

目的：建立一种简单、高效的小鼠主动脉血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）原代培养方法及体外钙化模型。方法：采用改良的组织贴块法培养小鼠VSMCs，经免疫荧光染色法鉴定后，将细胞随机分为对照组和钙化组。采用von kossa染色及比色法检测两组细胞内钙含量。结果：培养3～5 d时，可见细胞从组织块边缘爬出，7～10 d后细胞融合成片；免疫荧光染色显示胞质表达特异性α-肌动蛋白；VSMCs培养至第2代细胞纯度达95%；与对照组相比，钙化组细胞的钙含量、碱性磷酸酶（ALP）活性明显增加（P均＜0.05）。结论：改良的组织贴块法可获得高纯度的小鼠VSMCs；β-甘油磷酸钠在体外可有效诱导其钙化。

血管平滑肌细胞；原代培养；钙化

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）是血管壁的重要组成部分，通过协调血管收缩和舒张，控制血管压力和流速。VSMCs的异常分化、迁移和增殖是损伤后血管重构的基本环节［1］。此外，VSMCs还是参与血管钙化致动脉粥样硬化的关键细胞，在特定条件下，可向成骨细胞样表型转化进而产生钙化［2］。

VSMCs的体外培养和细胞株的建立是研究其生物学行为，探讨相关疾病发病机制及防治的重要基础。因此，熟练掌握VSMCs培养技术对相关疾病的研究具有重要意义。目前，主要采用组织贴块法、胰蛋白酶消化法等传统方法进行VSMCs的原代及传代培养。我们对传统组织贴块方法进行改良，采用机械剥离与组织贴块法相结合的方法，短期内成功获得大量高纯度、生长状态良好的VSMCs，并在高磷环境下快速建立体外VSMCs钙化模型。

1 材料与方法

1.1 材料

C57BL／6小鼠2只，雌雄不限，4～6周龄，体质量15～20 g，购于江苏大学实验动物中心，动物合格证号为SCXK（苏2009-0002）。DMEM／F12高糖培养基、胎牛血清、胰酶均购自美国Gibco公司，β-甘油磷酸钠、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）、4，6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI）购于Sigma公司，von kossa染色液购于上海舜百生物科技有限公司，碱性磷酸酶（ALP）测试盒、钙测试盒、总蛋白定量试剂盒购于南京建成生物工程研究所，小鼠α-肌动蛋白抗体购自美国Santa Cruz公司，大鼠抗小鼠IgG Cy3标记二抗购于北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 取材及机械剥离 颈椎脱臼法处死小鼠，置于75%的乙醇中浸泡5 min，固定后依次剪开胸腹部皮肤、肌肉层及胸骨，充分显露胸腔，取出胸主动脉，避免牵拉，纵向剖开血管，内膜朝上，用眼科镊从左侧位向右推移至中膜层翘起，直至中膜层完全剥离，PBS反复冲洗，备用。

1.2.2 组织贴块 将中膜剪成1～2 mm3组织块，均匀贴放于25 cm2培养瓶底，加入含20%胎牛血清的DMEM／F12培养液5 mL，侧放，37℃，5%CO2培养箱中静置1 h，缓慢反转培养瓶，使组织块浸没于培养液中，继续培养，待组织块周围细胞相互融合后剔除组织块，细胞生长至70%时原瓶传代。

1.2.3 细胞传代及纯化 弃培养液，PBS清洗，加入0.25%胰蛋白酶，待细胞回缩、间隙增大时终止消化，轻轻吹打细胞，离心，弃上清，重悬细胞，计数后传代培养；每隔2天换液1次，待细胞融合成致密单层后即可再次传代。

1.2.4 免疫荧光染色 取第2代对数生长期细胞，以每孔2×105个细胞接种于24孔板中，24 h后待细胞自然贴壁、生长良好时，弃培养基，PBS清洗，4%低聚甲醛固定，0.3%Triton-X 100透膜，BSA封闭，加入小鼠α-肌动蛋白一抗4℃孵育过夜，Cy3标记大鼠抗小鼠二抗37℃避光孵育1 h，DAPI复染核，镜下观察。

1.2.5 VSMCs体外钙化模型的制备 取第5 8代细胞，以每孔5×105个细胞接种于6孔板中，分为对照组（含10%胎牛血清的DMEM／F12培养液）和钙化组（含10%胎牛血清、10 mmol／Lβ-甘油磷酸钠、10 mmol／L丙酮酸钠、10－7mol／L胰岛素、50μg／mL维生素C的DMEM／F12培养液）［3］，只有β-甘油磷酸钠用于诱导VSMCs钙化。每隔2天换液1次。分别培养3，7，10，14 d，收集相应细胞用于钙定性、定量检测和ALP活性测定。

1.2.6 von kossa染色 收集各组正常细胞及钙化细胞，4%低聚甲醛固定，蒸馏水冲洗，加入5%硝酸银溶液，日光照射40 min，至棕褐色絮状物出现，5%硫代硫酸钠反应5 min，中性红复染1～3 min，镜下观察VSMCs钙盐沉积情况。

1.2.7 钙定量测试 取钙化3，7，10，14 d的细胞，弃培养液，PBS清洗2遍，每孔加入0.6%盐酸脱钙24 h，收集上清液，按照钙测试盒（甲基百里香酚蓝比色法）操作步骤检测各组细胞钙含量。脱钙后的细胞用冷PBS清洗，加入RIPA／PMSF（100∶1）裂解细胞，收集蛋白，细胞蛋白含量采用BCA法检测，以蛋白含量标化钙含量，即测得的钙含量除以蛋白含量（μmol／g）。

1.2.8 ALP测试 收集各组沉淀细胞，加入1% Triton X-100裂解，离心后取上清，按照ALP测试盒操作步骤检测各组细胞ALP活性，BCA法检测蛋白含量，并以蛋白含量标化ALP活性（U／g）。

1.2.9 MTT测定细胞增殖 取第5～8代细胞，以每孔2×104个细胞接种于96孔板中，分为对照组和钙化组，方法同“1.2.5”，分别培养24，48，72 h，于490 nm波长测定D值，计算钙化组与对照组D值的比值，绘制细胞生长曲线。

1.3 统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两组间均数比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞培养及鉴定

组织块接种培养3～5 d时，可见细胞从组织块边缘爬出，培养7～10 d后细胞生长迅速，细胞面积增大，融合成片，剔除组织块，可见“峰 谷”状生长，2 d后原瓶传代。培养第2代细胞行特异性α-肌动蛋白免疫荧光染色，可见胞质呈红色，内有大量与细胞长轴平行的纤维细丝，即肌动蛋白，细胞计数法计 算VSMC阳性率达95%。见图1。

图1 组织贴块法培养的血管平滑肌细胞

2.2 体外培养的小鼠VSMC钙化参数

von kossa染色结果显示，对照组未见明显钙沉积，钙化组3 d即可见少量棕黑色颗粒状钙沉积，7 d后钙化显著，多聚集在细胞周围（图2）。钙化组细胞内钙含量、ALP活性较对照组均明显升高，且呈时间依赖性（P均＜0.05）。见表1。

图2 小鼠血管平滑肌细胞von kossa染色（×200）

表1 2组血管平滑肌细胞钙化指数 ±s

表1 2组血管平滑肌细胞钙化指数 ±s

指标 组别 3 d 7 d 10 d 14 d F值 P值对照组 27.625±1.360 27.364±0.501 28.944±0.078 31.Ca2＋含量（μmol／g）355±1.916 4.602 0.087钙化组 122.718±6.822 231.459±20.260 359.304±26.986 587.701±13.698 232.798 0.000 t值 －19.329 －14.242 －17.312 －56.884 P值0.003 0.005 0.003 0.000对照组 2.016±0.038 2.049±0.038 2.057±0.045 2.166± ALP活性（U／g）0.061 3.824 0.114钙化组 3.702±0.003 5.021±0.100 6.260±0.060 7.060±0.056 1 017.040 0.000 t值 －35.485 －39.028 －78.776 －82.501 P值0.018 0.001 0.000 0.000

3 讨论

VSMCs的异常增殖和迁移是导致动脉粥样硬化、高血压、血管成形术后再狭窄等多种心血管疾病的病理基础［4－5］。

随着对VSMC异常增殖、迁移、分泌及表型重塑等方面的认识不断深化，体外高效培养高纯度的血管平滑肌细胞成为研究的重要环节。传统的原代VSMC体外培养方法主要有组织贴块法、胰蛋白酶消化法和胶原酶消化法。传统方法对血管损伤大，效率低，细胞纯度不够，特别是小鼠主动脉细小，成功率低。酶消化法时间不易掌握，对操作者要求较高。本研究对传统组织贴块方法进行改良，采用机械剥离与组织贴块法相结合，血管损伤小，组织块存活率高，细胞纯度95%以上，生长状态良好，第3代细胞即可用于实验，缩短了实验进程。

本实验中，我们总结出与原代细胞培养的存活率及纯度密切相关的几个实验注意点。①血管采集：打开小鼠胸腔后小心分离血管，血管分支用剪刀剪断，避免牵拉及血管破损。② 机械钝性分离：无须剔净外膜，立体显微镜下采用显微外科剪纵向剪开血管，显微外科镊沿血管长轴反复摩擦推移至血管外膜层与血管分离；小鼠主动脉血管内膜层较薄，无须刮除。③组织贴块：将组织块剪成1～2 mm2，组织块过大细胞不易爬出，组织块间隔2～3 mm，小心吸去组织块周围液体，有利于组织块尽快贴壁，减少组织脱落。④尽量缩短整个操作流程，控制在1 h以内，时间越短，组织块存活率越高。

血管钙化是动脉粥样硬化、糖尿病等病理状态下骨特异性羟基磷灰石结晶主动沉积在血管壁的异常过程，可发生在动脉壁的内膜和中膜［6］。流行病学研究显示，90%冠心病患者伴有血管钙化。导致动脉粥样硬化的危险因素如血脂异常、高血压、糖尿病、慢性炎症状态等均可促进血管钙化的形成与发展。分布于动脉粥样硬化斑块内微钙化灶极易引起斑块破裂，是造成急性心肌梗死、动脉夹层的重要原因［7－8］。本实验采用β-甘油磷酸钠诱导小鼠主动脉血管平滑肌细胞发生钙化，钙盐主要沉积在细胞周围，为进一步探讨动脉硬化钙化形成机制提供了理想的细胞模型。

［1］ Proudfoot D，Shanahan C.Human vascular smoothmuscle cell culture［J］.Methods Mol Biol，2012，806：251－263.

［2］ Gonzalez M，Martnez R，Amador C，et al.Regulation of the sodium-phosphate cotransporter Pit-1 and its role in vascular calcification［J］.Curr Vasc Pharmacol，2009，7（4）：506－512.

［3］ Shioi A，Nishizawa Y，Jono S，et al.β-glycerophosphate accelerates calcification in cultured bovine vascular smooth muscle cells［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1995，15（11）：2003－2009.

［4］ Nie L，Wise ML，Peterson DM，et al.Avenanthramide，a polyphenol from oats，inhibits vascular smooth muscle cell proliferation and enhances nitric oxide production［J］.Atherosclerosis，2006，186（2）：260－266.

［5］ Lyemere VP，ProudfootD，Weissberg PL，etal.Vascular smoothmuscle cell phenotypic plasticity and the regulation of vascular calcification［J］.J Intern Med，2006，260（3）：192－210.

［6］ Nicoll R，Henein M.Extensive coronary calcification：a clinically unrecognised condition［J］.Curr Vasc Pharmacol，2010，8（5）：701－705.

［7］ Maldonado N，Kelly-Arnold A，Vengrenyuk Y，etal.A mechanistic analysis of the role ofmicrocalcifications in atherosclerotic plaque stability：potential implications for plaque rupture［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2012，303（5）：H619－628.

［8］ Demer LL，Tintut Y.Vascular calcification：pathobiology of amultifaceted disease［J］.Circulation，2008，117（22）：2938－2944.

A modified method for primary culture and calcification of aortic vascular smooth muscle cell ofmouse

XU Li-hua，YAN Jin-chuan，WU Chao，LU Zhao-yang，WANG Zhong-qun，YUANWei
（Department of Cardiology，Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To establish a simple and efficientmethod for primary culture ofmouse aortic vascular smooth muscle cells（VSMCs）and calcification model in vitro.M ethods：The primary VSMCs were harvested bymodified tissue-piece inoculation and identified by immunocytochemistry.The established VSMCswere randomly divided into control group and calcification group.Calcification of cellswas assayed by von kossa staining and colorimetrymethod.Results：VSMCsmigrated from explants ofmouse aorta tissue after 3-5 days of culture.After 7-10 days，VSMCs grew to form a fusing monolayer.Immunofluorescence staining with specificmAb againstmouseα-actin demonstrated VSMCswere positive.The cell purity of the 2ndgeneration of VSMCswas over 95%.Compared with the control group，the calcium content and ALP activity in the calcification group were increased significantly（both P＜0.05）.Conclusion：The method ofmodified explant-culture successfully established a effectivemodel for primary culture of VSMCs，of which calcification in vitro could be induced byβ-glycerophosphate.

vascular smooth muscle cell；primary culture；calcification

R543

A

1671－7783（2014）02－0110－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y130262

国家自然科学基金资助项目（81170279，81370409）；江苏省自然基金及创新团队基金资助项目（BK2011486，LJ201116）；镇江市心血管病重点实验室（SS2012002）

徐丽华（1987—），女，硕士研究生；严金川（通讯作者），教授，博士生导师，E-mail：yanjinchuan＠hotmail.com

2013－11－27 ［编辑］刘星星