新型三唑类衍生物的合成及其抗真菌活性研究

吴茂诚，李 翔， 吴秋业 (第二军医大学药学院有机化学教研室，上海 200433)

近年来，深部真菌感染的发病率逐年上升，严重威胁人类健康[1]。三唑类药物是临床应用最为广泛的一类新型抗真菌药物，其代表药物氟康唑、酮康唑和伏立康唑已成为治疗深部真菌感染的一线用药。但也由于此类抗真菌药物在临床上的长期大量使用，使得真菌的耐药性问题日益突出，临床上迫切需要广谱、高效、低毒的新型抗真菌药物。因此,设计合成新型抗真菌药物成为研究中的热点，尤其是以氟康唑为先导化合物的衍生物的合成。氟康唑有很好的体内抗真菌活性，但是耐药性比较严重[2]。

以氮唑类化合物的抗真菌作用机制及构效关系为基础，本研究在设计时保留氟康唑的基本药效团二氟苯基、三唑环和叔醇结构[3,4]，同时引入萘环以及烃基等疏水基团，以增加脂溶性，调节油水分配系数，以期能够提高抗真菌活性，改善耐药性。

本研究共设计合成了9个未见文献报道的化合物，目标化合物的合成路线如图1、图2所示：

1 仪器和试剂

Yamato model MP-21型熔点测定仪(温度未经校正)，Broker Spectrospin AC-P 300型核磁共振仪(CDC13为溶剂，TMS为内标),Agilent 1100系列液相质谱联用仪,Heodolph LABOROTA 4000旋转蒸发仪，三用紫外分析仪SHB-ШA，循环水式多用真空泵ZF78(上海豫康科教仪器设备有限公司)。薄层色谱硅胶板和柱层析硅胶(烟台江友公司)，所有试剂均为市售分析纯或化学纯。

2 合成实验

2.1 2-氯-2′,4′-二氟苯乙酮(2)的制备 取无水间二氟苯150 g(1.30 mol)和三氯化铝200 g(1.49 mol)置于1 000 ml三颈瓶中，室温下慢慢滴加氯乙酰氯150 g(1.30 mol)，滴加完毕后室温搅拌30 min，升温至45 ℃，继续搅拌4.5 h，TLC监测，反应完毕，将反应液倒入冰水中，析出固体，过滤，滤液用800 ml二氯甲烷分两次萃取，合并二氯甲烷，水洗至中性，无水硫酸钠干燥，真空浓缩得白色固体，合并两次得到固体用乙醇重结晶，得到2-氯-2′,4′-二氟苯乙酮215 g，收率88.0%，mp：46～48 ℃[5]。

图1 中间体的合成路线

图2 目标化合物的合成路线

2.2 2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2′,4′-二氟苯乙酮(3)的制备 取三氮唑54 g (0.4 mol)、TEBA 0.8 g (0.003 5 mol)，无水碳酸钾82 g (0.3 mol)，二氯甲烷400 ml置于1 000 ml三颈瓶中得悬浮液。将2-氯-2′,4′-二氟苯乙酮76 g(0.4 mol)溶于60 ml二氯甲烷中，冰浴下滴入上述悬浮液中，0～5 ℃下反应5 h后，常温下继续反应24 h。TLC监测，反应完毕，过滤，滤饼用二氯甲烷洗数次，收集滤液，用水100 ml×3萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，真空浓缩。将残留物溶于乙酸乙酯200 ml中，搅拌下滴加浓硝酸，至黄色固体不再析出为止；过滤，滤饼用少量乙酸乙酯洗3次，干燥，再溶于200 ml水中，用30%的氢氧化钠水溶液调pH至9，析出固体，过滤，干燥得粗品，用正己烷:乙酸乙酯(V/V)1:1重结晶，得化合物76 g，收率42.0%，mp：104～105 ℃[6]。

2.3 1-[2-(2,4-二氟苯基)-2,3-环氧丙基]-1H-1,2,4-三唑甲磺酸盐(4)的制备 取2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2′,4′-二氟苯乙酮58 g (0.23 mol)、三甲基氧硫化碘50 g(0.23 mol)、十六烷基三甲基溴化铵3.2 g (0.008 8 mol)置于1 000 ml三颈瓶中，加入甲苯400 ml和20%氢氧化钠水溶液450 ml，60℃加热3 h，反应结束后，分离出甲苯层，水层再用甲苯200 ml×2萃取，合并甲苯层，水洗至中性，回收绝大部分甲苯后，残留液加乙酸乙酯240 ml稀释，0℃下滴加溶有甲磺酸16 g的乙酸乙酯5 ml，析出淡黄色固体，过滤，乙醇重结晶，得化合物1-[2-(2,4-二氟苯基)-2,3-环氧丙基]-1H-1,2,4-三唑甲磺酸盐44 g，收率58.0%，mp：128～129℃。

2.4 1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-(2,4-二氟苯基)-3-(N-正丙基氨基)-2-醇的制备 取1-[2-(2,4-二氟苯基)-2,3-环氧丙基]-1H-1,2,4-三唑甲磺酸盐21 g (0.06 mol)置于500 ml三颈瓶中，加入乙醇300 ml溶解，加入正丙胺10 ml，缚酸剂三乙胺20 ml，加热回流8 h，TLC监测，反应完毕后减压蒸除溶剂，用乙酸乙酯200 ml萃取，水100 ml×2洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除乙酸乙酯，得油状1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-(2,4-二氟苯基)-3-(N-正丙基氨基)-2-醇13.6 g，收率68.0%。

2.5 1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-(2,4-二氟苯基)-3-(N-异丙基氨基)-2-醇的制备 取1-[2-(2,4-二氟苯基)-2,3-环氧丙基]-1H-1,2,4-三唑甲磺酸盐21 g (0.06 mol)，加入乙醇300 ml溶解于500 ml三颈瓶中，加入异丙胺10 ml，缚酸剂三乙胺20 ml，加热回流8 h，TLC监测，反应完毕后蒸除溶剂，用乙酸乙酯200 ml萃取，水100 ml×2洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除乙酸乙酯，得油状1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-(2,4-二氟苯基)-3-(N-异丙基氨基)-2-醇15.6 g，收率72.0%。

2.6 1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-(2,4-二氟苯基)-3-(N-环丙基氨基)-2-醇的制备 取1-[2-(2,4-二氟苯基)-2,3-环氧丙基]-1H-1,2,4-三唑甲磺酸盐21 g (0.06 mol)，加入乙醇300 ml溶解于500 ml三颈瓶中，加入环丙胺10 ml，缚酸剂三乙胺20 ml，加热回流8 h，TLC监测，反应完毕后减压蒸除溶剂，用乙酸乙酯200 ml萃取，水100 ml×2洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除乙酸乙酯，得油状1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-(2,4-二氟苯基)-3-(N-环丙基氨基)-2-醇14.4 g，收率70.0%。

2.7 1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-(2,4-二氟苯基)-3-(N-烯丙基氨基)-2-醇的制备 取1-[2-(2,4-二氟苯基)-2,3-环氧丙基]-1H-1,2,4-三唑甲磺酸盐21 g (0.06 mol)置于500 ml三颈瓶中，加入乙醇300 ml溶解，随后加入烯丙胺10 ml，缚酸剂三乙胺20 ml，加热回流8 h，TLC监测，反应完毕后减压蒸除溶剂，用乙酸乙酯200 ml萃取，水100 ml×2洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除乙酸乙酯，得油状1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-(2,4-二氟苯基)-3-(N-烯丙基氨基)-2-醇12.9 g，收率64.2%。

2.8 1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-(2,4-二氟苯基)-3-(N-炔丙基氨基)-2-醇的制备 取1-[2-(2,4-二氟苯基)-2,3-环氧丙基]-1H-1,2,4-三唑甲磺酸盐21 g (0.06 mol)置于500 ml三颈瓶中，加入乙醇300 ml溶解，随后加入炔丙胺10 ml，缚酸剂三乙胺20 ml，加热回流8 h，TLC监测，反应完毕后减压蒸除溶剂，用乙酸乙酯200 ml萃取，水100 ml×2洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除乙酸乙酯，得油状1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-(2,4-二氟苯基)-3-(N-炔丙基氨基)-2-醇12.8g，收率62.0%。

2.9 1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-(2,4-二氟苯基)-3-(N-乙基氨基)-2-醇的制备 取1-[2-(2,4-二氟苯基)-2,3-环氧丙基]-1H-1,2,4-三唑甲磺酸盐21 g (0.06 mol)置于500 ml三颈瓶中，加入乙醇300 ml溶解，加入原料乙胺10 ml，缚酸剂三乙胺20 ml，加热回流8 h，TLC监测，反应完毕后减压蒸除溶剂，用乙酸乙酯200 ml萃取，水100 ml × 2洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除乙酸乙酯，得油状1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-(2,4-二氟苯基)-3-(N-乙基氨基)-2-醇14.4 g，收率70.0%。

2.10 1-溴甲基萘的制备 取1-甲基萘1 g(7 mmol)置于100 ml单颈瓶中，加入四氯化碳12 ml溶解，加入BPO 0.1 g (0.000 4 mol)，分多次加入NBS 1.5 g(8.4 mmol)，光照条件下加热回流6 h。TLC监测(PE为展开剂)，反应结束后冷却，过滤，CCl4洗涤，蒸干滤液，得1-溴甲基萘1.4 g，收率90.0%。

2.11 目标化合物1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-(2,4-二氟苯基)-3-(N-烯丙基-N-萘苄基氨基)-2-醇 (1a)的制备 取1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-(2,4-二氟苯基)-3-(N-烯丙基氨基)-2-醇306 mg(0.9 mmol)、1-溴甲基萘221 mg(1.0 mmol)、无水碳酸钾150 mg(1.1 mmol)置于50 ml茄型瓶中，加入乙腈20 ml，室温反应24 h，反应结束后，过滤，蒸干溶剂，先加入少量水，随后用乙酸乙酯(50 ml×3)萃取，合并乙酸乙酯层，无水硫酸钠干燥、浓缩，柱层析[展开剂：石油醚:乙酸乙酯(V/V)4:1]，最后得1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-2-(2,4-二氟苯基)-3-(N-烯丙基-N-萘苄基氨基)-2-醇287 mg，收率62.0%。化合物1b-1i制备方法同上。

合成的9个目标化合物的理化常数及波谱数据见表1。

3 药理实验

8种实验真菌菌株由第二军医大学药学院真菌室提供，目标化合物对8种致病菌(C.alb.SC5314,C.alb.Y0109,C.neo.,C.par.,C.tro.,T.rub.,C.kef.,A.fum.)的体外抑菌活性测试结果如表2所示。阳性对照药为伊曲康唑 (ICZ)、特比萘芬(TBF)、酮康唑(KCZ)、两性霉素B(AMB)、伏立康唑(VCZ)和氟康唑 (FCZ)。采用美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)提出的标准化抗真菌敏感性实验方法[7]测试了化合物的体外抑菌活性。

表1 目标化合物结构、熔点和波谱数据

表2 目标化合物的体外抗真菌活性(MIC80，μg/ml)

续表2

4 结果与讨论

从化合物的体外抑菌活性数据可以看出，1b和1c对除烟曲霉菌以外的其他真菌都有较强的抑制活性。1b对克柔念珠菌、红色毛癣菌和新型隐球菌的抑制活性和伏立康唑相当，对白念珠菌(SC5314，Y0109)的抑制活性则是伏立康唑的4倍和16倍，对红色毛癣菌的抑制活性是伏立康唑的4倍。而化合物1c对除烟曲霉菌以外的其他7种真菌的抑制活性几乎都是伏立康唑的16倍，酮康唑的65倍，伊曲康唑的260倍，两性霉素B和氟康唑的1 000倍。化合物1c侧链中含有环丙基，其对除烟曲霉菌以外的其他7种真菌的抑制活性特别突出，比其他侧链中含有其他取代基的化合物活性要高出很多，分析可能是环丙基作为疏水基团与靶酶的疏水腔结合较好，证明环丙胺开环后N原子上引入环丙基大大提高了化合物的抗真菌活性，由于化合物数量有限，更深入的构效关系探讨有待于进一步的研究。

【参考文献】

[1] Zou Y, Yu S, Li R,etal. Synthesis, antifungal activities and molecular docking studies of novel 2-(2,4-difluorophenyl)-2-hydroxy-3-(1H-1,2,4-triazol-1-yl)propyl dithiocarbamates[J].Eur J Med Chem, 2014,74(3):366-374.

[2] Tang H, Zheng CH, Ren XH,etal. Synthesis and biological evaluation of novel triazole derivatives as antifungal agents[J].Chin Chem Lett, 2013,24(3): 219-222.

[3] Wang S, Jin G, Wang W,etal.synthesis and structure-activity relationships of new triazole derivatives containing N-substituted phenoxypropylamino side chains[J]. Eur J Med Chem, 2012,53(4): 292-299.

[4] Zou Y, Zhao Q, Liao J,etal. New triazole derivatives as antifungal agents: synthesisviaclick reaction,invitroevaluation and molecular docking studies[J].Bioorg Med Chem Lett, 2012,22(8) :2959-2962.

[5] Jiang Y， Zhang J， Cao Y，etal. Synthesis,invitroevaluation and molecular docking studies of new triazole derivatives as antifungal agents[J]. Bioorg Med Chem Lett，2011, 21(15): 4471-4475.

[6] Chai X， Zhang J， Cao Y，etal. Design, synthesis and molecular docking studies of novel triazole as antifungal agent[J]. Eur J Med Chem， 2011, 46(7): 3167-3176.

[7] National Committee for Clinical Laboratory Standards.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts approved standard[S]. Document M27-A2, Wayne, PA, 2002.