山羊雪旺氏细胞培养方法和技巧

夏许可，章 莹

雪旺氏细胞作为外周神经的胶质细胞，主要参与髓鞘的构成，并可分泌多种神经营养因子，对外周神经系统生长、发育及神经损伤后的修复具有重要作用[1-2]。原代培养是获取雪旺氏细胞的重要手段[3]，本文介绍初生山羊坐骨神经体外分离、培养雪旺氏细胞（图1）的常用方法和技巧。

1 取材与保存

初生山羊体积较大，坐骨神经较鼠类更为粗大，易于辨认。麻醉后消毒，沿髋关节-腓骨小头连线切开皮肤并分离皮下肌层，即可见坐骨神经及胫神经、腓总神经两大分支。游离并切取长约4 cm的坐骨神经束，即完成取材。山羊雪旺氏细胞活性明显低于鼠类，且坐骨神经束粗大，对缺氧环境耐受性差，取材后神经束保存时间与接种后雪旺氏细胞成活率、产量关系密切，因此需要尽快行后期处理。若暂时不具备后期处理条件，宜将神经束去除束膜后尽量剪碎并置于4℃预冷的DMEM-F12培养液中，于5 h内完成接种。若将整条神经束置于预冷培养液中保存，则后期接种成功率较低。取材过程中应注意无菌，后期可应用无菌PBS缓冲液多次冲洗神经束以避免污染。

2 消化与接种

手术取出的神经束置于超净台内并剥离神经外膜，减少接种后成纤维细胞的数量，增加雪旺氏细胞的纯度。将神经束置于培养皿内并加入0.5 mL培养液，以无菌剪刀反复剪碎5～10 min，剪碎程度越高则越有利于雪旺氏细胞释放，一般以无肉眼可见组织块为标准。此步骤至关重要，直接关系到接种的成败。

2.1 消化

常用的消化方法包括：①组织块法：即剪碎后的组织不经蛋白酶消化，直接接种于培养瓶中；②一次酶法：将剪碎后的组织块以胰蛋白酶单次消化30～60 min，而后取上清细胞悬液接种；③二次酶法：将组织块先以胰蛋白酶消化约10～15 min，离心沉淀后再次以胰蛋白酶或胰蛋白酶-胶原蛋白酶混合液消化10～15 min后接种，与一次酶法比较，此法对神经束消化较为彻底，提高接种成功率，但较前两者而言，二次酶法成本稍高，且酶消化时间较前两者稍长，可能对细胞活性产生一定影响[4]。

2.2 接种

消化后即可离心取上层细胞悬液进行接种，亦可直接取组织匀浆接种[5]。以加样枪反复吹吸酶-组织匀浆混合液，离心后以含10%胎牛血清的DMEM-F12培养液重悬沉淀并接种于培养瓶内。接种3～4 d后将漂浮的未贴壁组织块转移至新培养瓶中贴壁，原培养瓶中仅保留少量组织块继续贴壁。接种4～5 d可见新培养瓶中大量组织块贴壁，其下方可见中等量强折光性细胞自组织块中心向周围爬行生长，细胞呈长梭形，两端尖细，中部可见膨大细胞核；细胞呈“肩并肩”样密集排布，有漩涡样集落生成。另可见少量形状不规则的细胞，多突起，核大居中，边界不清，呈平铺样贴壁生长，符合成纤维细胞形态特征。与离心后取上清的接种法比较，不进行离心而直接以夹杂组织块的匀浆接种获得雪旺细胞产量更优，也更为稳妥[6]。其原因包括：剪碎、消化过程意在为雪旺氏细胞暴露并脱离神经束创造条件，但这一过程并不能保证产生足够数量的游离雪旺氏细胞，单纯以离心去沉淀上清液接种可能造成游离雪旺氏细胞数量不足、细胞密度过低，进而导致接种失败；如在接种时夹杂少量神经组织块，使雪旺氏细胞直接自组织块爬行生长至培养瓶表面，则可大大增加雪旺氏细胞的接种成功率。此外，接种组织块不宜过多，避免组织生长旺盛造成培养环境缺氧，雪旺氏细胞尚未贴壁即因缺氧导致死亡。

图1 接种和传代过程中雪旺氏细胞图片（×200）

3 增殖与传代

培养5～7 d可见培养瓶中雪旺氏细胞呈集落样分布，局部较为密集，此时可加入少量胰蛋白酶消化，使培养瓶中部分雪旺氏细胞脱落，均匀分布瓶底后重新加入培养液终止消化。待细胞生长密集、密度增大后，适时进行传代。首先倾去培养液，以37℃预热PBS缓冲液洗涤瓶内细胞1～2次，后以3 mL胰蛋白酶室温消化1 min，移至倒置相差显微镜下可见细胞边界圆钝、回缩，此时以吸管反复轻柔吹吸瓶底，使全部细胞脱落，悬液离心，并以培养基重悬底部沉淀后接种于2个培养瓶中培养。山羊雪旺氏细胞增殖速度较鼠类稍慢，贴壁后4～5 d可进行传代，7～8代后生长逐渐变缓，故应及时冻存[7]。

4 冻存与复苏

雪旺氏细胞生命力较为顽强，以常规细胞冻存方法保存即可，无特殊要求。冻存液由DMEM-F12、胎牛血清、二甲基亚砜以8∶1∶1体积比配制[8]。细胞冻存前一天换液，冻存当日倾去瓶内培养液，以胰蛋白酶消化全部细胞后离心，后以前述冻存液重悬底部沉淀，以冻存管存放于程序冻存盒，置于—80℃超低温冰箱过夜，第二天转移至—196℃液氮长期冻存。复苏时将冻存管置入37℃水浴中快速融化后离心，以含10%胎牛血清的DMEM-F12培养液重悬沉淀并接种于培养瓶内，隔日可见大量雪旺氏细胞贴壁生长，隔日换液后正常培养。

5 纯化

目前，针对雪旺氏细胞的纯化培养方法众多，主要包括物理、化学、生物方法[3,9-11]。物理方法主要为差速贴壁法，利用雪旺氏细胞贴壁慢于成纤维细胞的特性，于传代过程中先期收集首先消化下来的雪旺氏细胞，或将细胞全部消化后一次性接种，待2 h后大部分成纤维细胞已贴壁而雪旺氏细胞尚未贴壁这一临界状态出现时，将雪旺氏细胞悬液转移至另一培养瓶内贴壁培养，此法简便易行，成本低，效果明显；化学方法主要是利用化学试剂实现纯化的目的，如使用Ara-c抗有丝分裂剂达到去除成纤维细胞的目的[12]；生物方法主要是应用免疫磁珠技术对细胞进行流式分选，此法特异性强，可获得高纯度雪旺氏细胞，但成本高、操作复杂，适用于取材、培养困难，细胞产量低的情况[13]。有研究显示，当雪旺氏细胞纯度低于75%时，传代后成纤维细胞很快成为优势细胞，此时应用前述物理、化学方法纯化雪旺氏细胞效果不佳[14]。

山羊雪旺氏细胞的培养与鼠类相比难度稍大，在保证新鲜取材的基础上细致操作、严格无菌观念是成功的关键。同时，要注意到大型动物细胞活性较小型动物下降更快这一特性，选择适当的培养液并合理添加血清，及时冻存细胞，以保证实验的顺利完成。

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