原生质体诱变提高亚麻刺盘孢ST对底物DHEA的 耐受性和转化率

李恒，吴燕，魏利莎，李会，张晓梅，史劲松，许正宏

（江南大学药学院，江苏 无锡 214122）

屈螺酮是一种高效、低毒、无副作用的新一代女用口服避孕药[1]。由于屈螺酮具有广阔的市场应用前景，其重要的前体化合物三羟基雄甾烯酮（7α，15α-diOH-DHEA）受到了广泛的关注。目前，7α，15α-diOH-DHEA的主要生产方法是化学合成法，存在反应步骤繁琐、产物得率低、环境污染严重等问题。20世纪70年代，德国先令公司（Schering AG）首次将生物转化法应用于屈螺酮的合成研究，利用微生物的羟化酶系统，在去氢表雄酮（DHEA）的C7、C15位双羟化得到7α,15α-diOH-DHEA，但转化率一直比较低，限制了其大规模的工业化应用。目前对DHEA具有转化能力的菌株主要来自Mucorracemosus、Fusarium moniliforme和Colletotrichumlini这几个菌属，其中以C. lini的催化活性最为显著[2-3]。但高浓度的DHEA对C. lini具有明显的毒害作用，因此，如何提高菌株底物耐受性，是实现高底物投料浓度和高转化效率必须要解决的一个 问题。

由于C. lini的遗传背景不清晰，因此非理性诱变育种是提高C. lini底物耐受性的首选。但丝状真菌细胞壁成分复杂，直接以孢子或菌丝体为诱变对象，诱变剂很难直接接触其遗传物质，造成突变率低且阳性突变株较少。自1953年Weibull首次用溶菌酶酶解分离到Bacillus megaterium的原生质体之后，更多的研究人员开始利用原生质体诱变技术选育菌种，已有利用原生质体诱变选育高产菌株的 实例[4-7]。

本研究以实验室保存的Colletotrichum liniST为出发菌株，研究其原生质体的制备和再生方法后，利用等离子诱变（ARTP）处理原生质体。通过抗性平板初筛和HPLC复筛，最终获得了一株遗传稳定性良好、底物耐受性较高的优势突变菌株，并考察了其转化特性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

亚麻刺盘孢ST，由本实验室保藏。

1.1.2 培养基

发酵培养基（g/L）：葡萄糖 15，酵母粉 15，玉米浆 3。种子培养基加10g/L豆饼粉。

PDA培养基（g/L）：马铃薯 200，葡萄糖 20，琼脂 20。

再生培养基（g/L）：马铃薯 200，葡萄糖 20，琼脂 5，渗透压稳定剂，在最佳培养条件研究时，组分及浓度进行相应调整。

FM培养基（g/L）：葡萄糖 15，酵母粉 15，玉米浆 3，琼脂5。

査氏培养基（g/L）：NaNO33，K2HPO41，KCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.01， 蔗糖 30，琼脂 8。

1.1.3 试剂

DHEA、7α,15α-diOH-DHEA标准品，购自浙江仙居君业药业有限公司；7α-OH-DHEA标准品由本实验室分离制备；纤维素酶、蜗牛酶、溶菌酶均购自上海生物工程公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 菌丝体的收集

将PDA斜面保存的亚麻刺盘孢菌丝体接种于无菌种子培养基，30℃、220r/min条件下培养24h，随后以10%的接种量接入30mL/250mL发酵培养基，同样条件下培养至对数期，12000r/min离心10min收集菌丝体，用于后续原生质体的制备。

1.2.2 原生质体的制备与再生

将收集的对数期菌丝体用渗透压稳定剂洗涤离心一次，加入适量的酶解液于水浴锅中酶解。过滤除菌体碎片后，酶解液离心弃上清，原生质体用渗透压稳定剂洗涤2次，重悬于1mL渗透压稳定剂中。制备的原生质体稀释104倍数后，采用倾倒法再生，其再生率计算如式（1）。

1.2.3 原生质体释放过程

原生质体稀释一定的倍数后，利用血球计数法计数。酶解过程每隔0.5h取样，于显微镜下观察原生质体的形态及释放过程。

1.2.4 原生质体诱变与优势突变株的筛选

C. liniST原生质体经ARTP照射后进行再生培养，以不经诱变的原生质体作为对照，计算诱变致死率，如式（2）。同时以底物浓度梯度为筛子进行抗性平板筛选，以不含底物的平板作为对照，计算底物致死率，如式（3）。从含有高浓度底物的抗性平板中挑取单菌落发酵培养后转化DHEA，测定7α，15α-diOH-DHEA得率，筛选优势突变株并保种。

1.2.6 突变株的评价

遗传稳定性考察：将突变株进行连续传代，测定产物7α,15α-diOH-DHEA得率，并以第一代为对照进行比较。

底物耐受性考察：将突变菌株与出发菌株在发酵培养基中培养24h后，分别加入不同浓度的DHEA继续培养24h。取1mL培养液过滤获得孢子，稀释一定倍数后涂布于PDA培养基，根据再生单菌落数计算菌体对DHEA的耐受性。其计算方法如 式（4）。

转化过程分析：将种子液按10%接种量转接到发酵培养基中，220r/min、30℃培养24h。随后向发酵液中投入10g/L DHEA，继续转化72h，测定转化过程曲线。

1.2.7 分析方法

采用高效液相色谱法（HPLC）检测DHEA、7α-OH-DHEA、7α,15α-diOH-DHEA的浓度。色谱柱，Agilent TC-C18 （4.6mm×250mm，5μm）；流动相，乙腈/水（7∶3，体积比）；柱温30℃；检测波长206nm；流速0.5mL/min；进样量10μL。产物得率计算方法如式（5）。

式中，C1为HPLC检测的7α,15α-diOH-DHEA浓度；C2为HPLC检测的DHEA浓度。

2 实验结果与分析

2.1 原生质体的制备

2.1.1 酶浓度对原生质体制备的影响

不同种类微生物在制备原生质体时所需酶的种类和浓度不同。丝状真菌细胞壁的主要成分是多糖、蛋白质和脂类。文献报道蜗牛酶、纤维素酶、溶壁酶这3种酶均可用于制备霉菌原生质体[8]，采用这3种酶制备C. liniST原生质体结果如表1所示。由表1可知，采用纤维素酶5mg/mL，蜗牛酶4mg/mL，溶菌酶1mg/mL的酶组合时原生质体的制备率最高，为1.19×108个/mL。另外，从表1还可以看出，在制备C. liniST原生质体时，溶菌酶的浓度对制备 率的影响非常小，而纤维素酶和蜗牛酶的浓度对制备率影响比较大，说明C. liniST的细胞壁主要是由纤维素和几丁质构成，而由溶菌酶降解的葡聚糖含量相对较低。

表1 不同酶组合对菌株原生质体形成数量的影响

2.1.2 酶解时间对原生质体制备的影响

在制备原生质体的过程中，酶解时间过短或过长都会显著影响原生质体的制备率。图1显示，C. liniST原生质体的制备率随着酶解时间的延长而增加，2.5h时制备率达到最高，为2.14×108个/mL。这可能是因为酶解时间过短，菌体脱壁不完全，原生质体不能完全释放，造成其制备率偏低；而酶解时间过长，酶解液中某些物质对早期释放的原生质体细胞膜有破坏作用，加之原生质体细胞膜本身的不稳定性，最终导致原生质体制备率急速下降。因此，酶解时间以2.5h最为适宜。

2.1.3 酶解温度对原生质体制备的影响

图1 不同酶解时间对原生质体制备的影响

图2 不同酶解温度对原生质体制备的影响

不同的裂解酶在不同的温度下其活性不同，进而影响原生质体的制备率。分别在30℃、32℃、 34℃、36℃制备C. liniST原生质体，结果如图2 所示。由图2可见，原生质体的制备率在32℃时达到最高，为2.22×108个/mL，而后随着温度的升高制备率降低。因此，后续实验以32℃作为C. liniST原生质体最适酶解温度。

2.2 原生质体的释放

将裂解酶加入菌丝体酶解体系，经过酶解反应后，在显微镜下观察原生质体的释放过程。由图3可知，随着酶解时间的延长，菌丝体逐渐减少，原生质体的数量逐渐增多。当酶解0.5h时，反应液中存在大量完整未被破坏的菌丝体，而当酶解时间达到2.5h时，菌丝体几乎完全裂解，并释放出大量的原生质体。另外，从图3(c)可看出，C. liniST原生质体多呈球形，中间一般含有一个液泡，其余的内含物呈月牙状，透明性较液泡差。这与相关文献报道的原生质体释放过程相一致[9]。

2.3 原生质体的再生

图3 C. lini ST原生质体释放过程

图4 不同培养基成分对原生质体再生的影响

适宜的培养基是保证原生质体进行再生重要因素之一。在C. liniST菌丝体固体培养基的基础上， 添加适量的渗透压稳定剂及营养因子，考察不同培养基对C. liniST原生质体再生率的影响。如图4所示，在4种PDA培养基中，原生质体的再生能力基本一致，补加酵母膏的再生率略高，再生率为9.48%。与之相比，C. liniST原生质体在査氏高渗和FM高渗培养基的再生率较低，推测可能是PDA培养基中的土豆浸出液可作为细胞壁合成的前体物质，也可能通过代谢转化成细胞壁的前体物质或起到促进代谢，加速细胞壁合成的作用。

2.4 原生质体等离子诱变

将C. liniST原生质体经ARTP照射不同时间后进行再生培养，根据再生单菌落计算其致死率，结果见图5。随着ARTP诱变时间的延长，原生质体致死率迅速增加。当照射时间为120s时，原生质体致死率达到95%左右。等离子诱变在致死率较高时比较易发生正向突变，故选择120s作为原生质体的处理时间。

2.5 突变株的选育

图5 不同诱变时间原生质体致死率

图6 不同DHEA浓度原生质体的致死率

原生质体经ARTP诱变处理后，以DHEA的浓度为筛子进行抗性平板筛选，DHEA对原生质体的致死率如图6所示。当DHEA的浓度为4g/L时， 致死率为32.8%；当DHEA浓度为12g/L时，致死率迅速增加到92.4%；当DHEA浓度为18g/L时，原生质体致死率已接近100%。由此可见，C. liniST原生质体的致死率在DHEA浓度为12～14g/L时易发生正向突变，选择14g/L DHEA的平板进行阳性突变株的初筛。

从抗性平板的单菌落中挑取60株突变株，转接于发酵培养基培养24h后，投入10g/L的DHEA转化72h，测定各突变株的7α，15α-diOH-DHEA得率。如图7所示，通过摇瓶转化实验验证，最终获得了6株产物得率有较大提高的菌株y-1、y-4、y-14、y-15、y-19和y-45。

2.6 突变株遗传稳定性考察

将6株突变株分别进行传代培养，以考察其遗传稳定性。如图8所示，经过连续5代的培养，得到了一株转化率高且稳定的菌株，命名为C. liniST-0317。其在DHEA浓度为10g/L的条件下，经过多次传代培养，7α,15α-diOH-DHEA的得率为36.5%～38.0%。

2.7 突菌株ST-0317底物耐受性

图7 突变菌株筛选

图8 突变株ST-0317的遗传稳定性

图9 出发菌株与优势菌株菌体活性的比较

以出发菌株ST作为对照，考察ST-0317对不 同浓度DHEA的耐受性。由图9可以看出，在DHEA浓度低于4g/L时，DHEA对菌体的毒害作用比较小，ST与ST-0317对底物的耐受性相差不大。但当DHEA浓度超过6g/L时，菌株ST-0317对DHEA的耐受性有显著提高。当底物浓度高达18g/L时，菌株ST-0317仍能保持62.4%的催化活性，而菌株ST已低于20%。由此可见，突变株ST-0317对高浓度底物的耐受性显著高于出发菌株ST。

2.8 突菌株ST-0317转化过程分析

将出发菌株ST、突变株ST-0317分别在发酵培养基中培养24h后，投入10g/L的DHEA，测定转化过程曲线，结果如图10所示。在前24h，菌株ST和ST-0317的双羟产物得率均比较低。随着转化时间的延长，出发菌株ST在72h时产物得率达到最高，为24.6%。而突变株ST-0317的转化速率明显高于出发菌株，在转化60h后，7α,15α-diOH- DHEA的得率可达到36.9%，比ST提高了50%。同时，ST-0317的转化周期也由72h缩短至60h。结果说明突变株ST-0317经等离子诱变后不但提高了对高浓度底物的耐受性，而且提高了其对DHEA的转化率。

图10 菌株ST和ST-0317的转化过程曲线

3 结 论

以C. liniST作为出发菌株制备原生质体，确定了C. liniST原生质体制备及再生的最佳条件。原生质体经ARTP诱变后，获得一株底物耐受性高且7α，15α-diOH-DHEA产量显著提高的突变株ST-0317。对其转化特性进行分析，在DHEA浓度为10g/L的条件下，ST-0317的7α,15α-diOH-DHEA得率为36.9%，比出发菌株提高50%，同时转化周期由72h缩短至60h。

原生质体诱变技术在提高C. liniST底物耐受性及转化率上取得了良好的效果，突菌株C. liniST-0317预期在经过发酵和转化条件的优化后，其转化能力会有更大幅度的提高。

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