橡胶树胶孢炭疽菌细胞自噬相关基因CgAtg4的克隆与序列分析

翟李刚+林春花+蔡志英+时涛+黄贵修

摘要：细胞自噬（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ）有助于植物病原真菌渡过营养饥饿、供氧不足等不良环境，有研究发现其与植物病原真菌的致病性相关。利用橡胶胶孢炭疽菌ＨＢＣｇ０１全基因组数据库，采用ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ克隆细胞自噬相关基因ＣｇＡtg４（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登录号：ＫＣ７３５１２５），并对其序列进行分析，研究细胞自噬在胶孢炭疽菌侵染橡胶树过程中的作用。结果表明，ＣｇＡtg４的开放阅读框（ＯＲＦ）为９６０ ｎｔ，编码３１９个ａａ序列，预测含有一个由２１３个ａａ组成的高度保守的Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ＿Ｃ５４蛋白酶结构域，与另外１９种真菌的Ａtg４氨基酸序列同源性为３８％～８７％。推测ＣｇＡtg４可能与橡胶树胶孢炭疽病菌的产孢能力、分生孢子萌发以及附着胞膨压的形成相关。

关键词：橡胶树；胶孢炭疽菌；自噬相关基因；ＣｇＡtg４

中图分类号：Ｓ４３２．４＋４；Q75文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０14）09－2189-03

Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｕｔｏｐｈａｇｙ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｇｅｎｅ ＣｇＡtg４ ｆｒｏｍ

Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ ｏｆ Ｒｕｂｂｅｒ Tree

ＺＨＡＩ Ｌｉ－ｇａｎｇ１，２，ＬＩＮ Ｃｈｕｎ－ｈｕａ１，ＣＡＩ Ｚｈｉ－ｙｉｎｇ１，ＳＨＩ Ｔａｏ１，ＨＵＡＮＧ Ｇｕｉ－ｘｉｕ１

（１．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ/Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｎ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｃｒｏｐｓ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ/Ｈａｉｎａｎ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｅｓｔｓ，Ｈａｉｋｏｕ ５７１１０１， Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｃａｎ ｈｅｌｐ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ ｓｕｒｖｉｖｅ ｉｎ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｈｕｎｇｅｒ， ｏｘｙｇｅｎ ｈｕｎｇｅｒ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ. ａｎｄ It is found to be ｒｅｌａｔｅｄ with ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ ｓｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈes． Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ explore ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｒｕｂｂｅｒ ｔｒｅｅ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ， ｔｈｅ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ＣｇＡtg４（Ｇｅｎｅｂａｎｋ ｎｕｍｂｅｒ：ＫＣ７３５１２５） ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ＲＴ－ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄｓ， ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ａｎａｌｙｓｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ database of ｒｕｂｂｅｒ ｔｒｅｅ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ ＨＢＣｇ０１ ｇｅｎｏｍｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ that ｔｈｅ ＣｇＡtg４ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ） ｗａｓ ９６０ ｎｔ， ｃｏｄｉｎｇ ３１９ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅ with ａ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ＿Ｃ５４ ｗｉｔｈ ２１３ ａａ． Ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｏｆ ＣｇＡtg４ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ Ａtg４ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ １９ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｆｕｎｇａｌｓ was ３８％ ｔｏ ８７％． Ｉｔ ｉｓ predictal that ＣｇＡtg４ ｇｅｎｅ is ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ， ｃｏｎｉｄｉｏｐｈｏｒｅ ｇｅｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｐｒｅｓｓｏｒｉｕｍ ｔｕｒｇｏｒ ｐｒｅｓｓｕｒｅ of rubber tree Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒｕｂｂｅｒ ｔｒｅｅ； Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ； ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ； ＣｇＡtg４

细胞自噬（Autophagy）是真核生物中广泛存在的作用机制，且在进化上十分保守，它是真核生物中对细胞内蛋白质和细胞器进行周转的重要过程，该过程中一些损坏的蛋白质或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体或液泡中进行降解并得以循环利用。自噬过程中最为重要的两个环节是自噬过程的诱导和自噬体的形成，参与此过程的至少有１７个Ａｔｇ（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，细胞自噬相关）蛋白，被分为５个功能组［１］：Ⅰ．Ａｔｇ１激酶功能组（Ａｔｇ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）；Ⅱ．Ａｔｇ９膜蛋白循环系统（Ａｔｇ９ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）；Ⅲ．Ａｔｇ８－磷脂酰乙醇胺（ＰＥ）功能组（Ａｔｇ８ ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）；Ⅳ．Ａｔｇ１２－Ａｔｇ５复合体功能组（Ａｔｇ１２－Ａｔｇ５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）；Ⅴ．磷脂酰肌醇转移蛋白３（ＰｔｄＩｎｓ３）－激酶复合体（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ－３ ｋｉｎａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）。Ａｔｇ４基因属于Ａｔｇ８－磷脂酰乙醇胺（ＰＥ）功能组，该基因能切割Ａｔｇ８羧基端的精氨酸，暴露出甘氨酸［２］，并在Ａｔｇ７和Ａｔｇ３的共同调节作用下形成Ａｔｇ８蛋白与磷脂酰乙醇胺复合物（Ａｔｇ８－ＰＥ），从而促进自噬体前体膜的聚集和融合［３］，进一步形成自噬体。

炭疽菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐｐ．）是一类常见且最重要的植物病原真菌之一，引起各种农作物炭疽病，造成重大的经济损失［４］。炭疽病已成为研究植物病原真菌生长发育、侵染过程及植物与病原菌互作机制的典型材料。由胶孢炭疽菌［Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ （Ｐｅｎｚｉｇ） Ｐｅｎｚｉｇ ｅｔ Ｓａｃｃａｒｄｏ］侵染引起的橡胶树炭疽病［５］是橡胶树重要叶部病害之一。该病可危害橡胶小苗、大田幼树直至成龄开割树，侵染叶片、叶柄和果实，严重时会引起橡胶树的重复落叶和嫩梢回枯，推迟开割时间［６］。至今，未见炭疽菌细胞自噬相关基因的报道。本研究在橡胶树胶孢炭疽菌全基因组测序的基础上，以细胞自噬基因家族中与自噬体形成相关的Ａｔｇ４基因为研究对象，对其进行基因克隆和序列分析，为后续的基因功能鉴定提供参考。

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１材料与方法

１．１供试材料

供试橡胶树胶孢炭疽病菌菌株ＨＢＣｇ０１，由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所分离自海南省儋州市发病橡胶树叶片。橡胶树品种热研７－３３－９７，由中国热带农业科学院橡胶研究所提供。

１．２试剂

ＨＢＣｇ０１病菌培养采用ＰＤＡ培养基，参照方中达［６］的方法制备。试剂：ＤＮＡ片段胶回收试剂盒、ｐＭＤ１８－Ｔ载体、ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ购自宝生物工程（大连）有限公司；Ｔａｑ酶和ｄＮＴＰ购自天根生化科技（北京）有限公司；大肠杆菌Ｔ１感受态细胞和ＲＮＡ提取试剂盒ＴｒａｎｓＺｏｌ Ｐｌａｎｔ购自北京全式金生物技术有限公司；引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成；其他试剂均为国产分析纯。

１．３方法

１．３．１引物设计在ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）数据库中搜索近源物种的Ａtg４基因序列，在ＨＢＣｇ０１全基因组数据库中分别进行本地Ｂｌａｓｔ检索，获得ＨＢＣｇ０１中的同源基因，根据５′端和３′端序列设计１对引物ＡＴＧ４－Ｆ和ＡＴＧ４－Ｒ。

１．３．２ＨＢＣｇ０１基因组ＤＮＡ、ＲＮＡ提取和ｃＤＮＡ的合成菌株在ＰＤＡ平板上２８ ℃培养７ ｄ后，收集菌丝。采用ＣＴＡＢ法［７］提取基因组ＤＮＡ。采用ＴｒａｎｓＺｏｌ Ｐｌａｎｔ和ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ试剂盒，参照说明书中相关步骤进行ＲＮＡ提取，去除基因组ＤＮＡ和ＲＮＡ的反转录。

１．３．３Ａtg４基因的ＰＣＲ扩增、克隆与序列分析 以ＨＢＣｇ０１基因组ＤＮＡ和ｃＤＮＡ为模板，用引物对ＡＴＧ４－Ｆ和ＡＴＧ４－Ｒ进行ＰＣＲ扩增，反应体系为：１０×ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）４ μＬ，ＭｇＣｌ２ ３ μＬ，１０ μｍｏｌ／Ｌ上下游引物各２ μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ酶（５ Ｕ／μＬ）０．５ μＬ，模板ＤＮＡ／ｃＤＮＡ ２ μＬ，加水补足至５０ μＬ。反应条件为：９４ ℃预变性５ ｍｉｎ，９４ ℃变性４５ ｓ，６０ ℃退火４５ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３５个循环，７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。扩增产物用质量分数１％的琼脂糖凝胶电泳检测，并回收目的片段。

扩增产物回收后克隆到ｐＭＤ１８－Ｔ载体上。经蓝白斑筛选后，采用碱裂解法［8］提取转化子的质粒ＤＮＡ，经ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切鉴定、菌落ＰＣＲ鉴定后，随机挑选３个阳性克隆送北京六合华大基因科技股份有限公司进行序列测定，确认序列后在ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ上进行比较分析，并预测相应蛋白质的保守结构域。采用ＤＮＡＭＡＮ软件将测序的核酸序列翻译成氨基酸序列，并在ＮＣＢＩ上对其进行Ｂｌａｓｔｐ检索，下载其他近源真菌的同源氨基酸序列，用ＭＥＧＡ Vｅｒｓｉｏｎ ４．０软件中的ＮＪ（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ）方法生成系统树，用Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ对系统树进行检验，１ ０００次重复。

２结果与分析

２．１引物的设计

利用稻瘟菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ）Ａｔｇ４基因（ＡＣＪ０６５８７．１）的ａａ序列和菌株ＨＢＣｇ０１的基因组数据库进行本地Ｂｌａｓｔ，结果表明该菌株中有一个预测的同源基因，分析其大小约１．１ ｋｂ，命名为ＣｇＡｔｇ４。根据该基因的５′端和３′端序列设计了１对引物ＡＴＧ４－Ｆ（５′－ＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＡＴＣ－３′）、ＡＴＧ４－Ｒ（５′－ＧＧＴＡＧＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＡＡＣＣＴ３－′）。

２．２橡胶树胶孢炭疽菌ＣｇＡｔｇ４基因的克隆

利用引物ＡＴＧ４－Ｆ和ＡＴＧ４－Ｒ对ＨＢＣｇ０１的基因组ＤＮＡ和ｃＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，分别得到约１．１ ｋｂ和１．０ ｋｂ的条带（图１），与预期的条带大小一致。测序结果显示，以基因组ＤＮＡ为模板扩增得到的产物大小为１ １２９ kb，以ｃＤＮＡ为模板扩增得到的产物大小为９６０ kb。

２．３ＣｇＡｔｇ４基因的序列分析

生物信息学分析表明，ＣｇＡｔｇ４基因含有一个完整的开放阅读框（ＯＲＦ），含有３个外显子和２个内含子，编码３１９个ａａ残基，分子量约为３５．０１ ｋＤ，等电点PＩ为５．１４，含有１１６个疏水性残基和２０３个亲水性残基，预测蛋白质中含有一个由２１３个ａａ组成的高度保守的Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ＿Ｃ５４蛋白酶结构域（图２）。该序列已提交ＮＣＢＩ数据库，登录号为ＫＣ７３５１２５。

在ＮＣＢＩ上将ＣｇＡtg４氨基酸序列进行Ｂｌａｓｔｐ检索，下载１９个菌株的Ａtg４基因氨基酸序列，利用ＭＥＧＡ Vｅｒｓｉｏｎ ４．０软件构建系统发育树（图３）。结果表明，ＣｇＡｔｇ４与胶孢炭疽菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ，ＥＬＡ２５６００．１）、菜心炭疽菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ，ＣＣＦ３９２７１．１）以及小丛壳属真菌（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ ＥＦＱ３６７５０．１）的同源性相对较高，分别为８７％、７８％和８０％，亲缘关系最近；与黏红酵母（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ，ＥＧＵ１３５８７．１）和酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，ＥＤＺ６９８０６．１）的Ａｔｇ４氨基酸序列同源性较低，分别为４３％和３８％，亲缘关系最远。

３讨论

１９６２年，Ａｓｈｆｏｒｄ等［９］用电子显微镜在人的肝细胞中首次观察到细胞自噬现象。关于该现象调控机制方面的研究较少，其作用机理尚不清楚。上世纪９０年代以来，酵母作为一种模式生物受到了关注，研究者开展了大量的自噬作用机制研究。目前，已发现３０多个基因参与酵母的自噬作用，其中１７个基因参与自噬泡的形成［１０］。

近年来有研究表明，细胞自噬过程与病原真菌的致病性密切相关。在稻瘟菌中，细胞自噬过程与稻瘟病菌的产孢、附着胞膨压、穿透、致病性以及有性生殖等各个发育阶段密切相关［１１，１２］。缺失ＭｇＡｔｇ４基因后，稻瘟菌突变体菌丝稀疏、产孢量下降、附着胞膨压降低，而且孢子萌发和附着胞形成延迟，接种大麦和水稻均不能形成病斑［１３］。ＣｇＡｔｇ４和ＭｇＡｔｇ４所编码的氨基酸序列具有６１％的同源性，都包含一个高度保守的Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ＿Ｃ５４蛋白酶结构域，推测ＣｇＡｔｇ４基因参与菌丝生长、产孢和侵染过程。

本研究成功克隆得到橡胶树胶孢炭疽菌与细胞自噬相关的ＣｇＡｔｇ４基因，利用ＮＣＢＩ分析其具有高度保守的Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ＿Ｃ５４蛋白酶结构域。基于该基因的ａａ序列，构建了系统发育树，分析了该基因氨基酸序列和其他真菌同源基因的亲缘关系。本研究为进一步研究ＣｇＡｔｇ４基因在橡胶树胶孢炭疽病菌自噬过程中的作用等提供了基础，有助于从分子生物学层面研究细胞自噬与橡胶树胶孢炭疽菌致病性的关系。

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［１１］ ＬＩＵ Ｘ Ｈ， ＬＵ Ｊ Ｐ， ＺＨＡＮＧ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ， ＭｇＡＴＧ１， ｉｎ ａｐｐｒｅｓｓｏｒｉｕｍ ｔｕｒｇｏｒ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］． Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌ， ２００７，６（６）：９９７－１００５．

［１２］ ＬＩＵ Ｘ Ｈ， ＬＵ Ｊ Ｐ，ＬＩＮ Ｆ Ｃ． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｄｕｒｉｎｇ ｃｏｎｉｄｉａｔｉｏｎ， ｃｏｎｉｄｉａｌ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｒｇｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ［Ｊ］． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ，２００７，３（５）：４７２－４７３．

［１３］ ＬＩＵ Ｔ Ｂ， ＬＩＵ Ｘ Ｈ， ＬＵ Ｊ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ＭｏＡｔｇ４ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＭｏＡｔｇ８ ａｎｄ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ［Ｊ］． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ， ２０１０，６（１）：７４－８５．

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