针刀对腰突根性神经痛大鼠外周镇痛机制的实验研究

付伟涛,郭长青*,梁楚西,黄怡然,张丽萍,崔成俊,朴起范,孙红梅,许 红,郭 健,赵淑英

(1.北京中医药大学针灸推拿学院，北京 100029；2.北京中医药大学基础医学院，北京 100029)

腰椎间盘突出症(Lumbar Disc Hernation，简称LDH)，又称“腰椎纤维环破裂症”或“腰椎髓核脱出症”。整脊学概括为“由于外力作用引起腰椎骨关节旋转、倾斜、错位，导致椎间盘突出椎间孔或椎管，刺激到脊神经或脊髓；或因骨关节错位、椎间孔移位，导致神经根位移与椎间盘产生卡压，引起腰椎活动障碍、腰痛、下肢放射性疼痛，称“腰椎间盘突出症”。[1]腰椎间盘突出症是常见病和多发病，对患者日常生活和工作造成严重影响。大量的临床报道肯定了针刀治疗腰椎间盘突出症的疗效[2-5]，但其作用机理仍处于假设和论证阶段。本实验通过观察腰椎间盘突出症根性神经痛大鼠血清中5-羟色胺(5-Hydroxytryptamine，5-HT)、β-内啡肽(β-endorphins，β-EP)含量的变化，探讨针刀疗法的外周镇痛机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 清洁级SD雄性健康大鼠40只,体质量(250±20) g。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供(动物生产许可批号SCXK(京)2001-0001)，北京中医药大学针灸推拿学院针灸机理实验室动物室喂养。适应性饲养7 d后，随机分为正常组、假模型组、模型组、针刀组，每组各10只。

1.2 主要仪器 HZ系列一次性使用针刀，规格0.4 mm×40 mm(汉章针刀,北京卓越华友医疗器械有限公司)；骨科手术器械(手术刀、剪、镊、钳);9号腰椎穿刺针(扬州市江洲医疗器械有限公司)；低温离心机(德国Eppendorf公司，5810R)MDF-U50A超低温冰箱(日本SANYO公司)；AE-160电子天平(瑞士METTLER公司);匀浆器、96孔板、移液器、离心管、医用缝合针、4号缝皮丝线；Thermo Multiskan MK3(产地：芬兰)。

1.3 主要试剂 75%酒精(北京海德润制药有限公司)；碘伏消毒剂(武汉同济美迪生科技有限公司);0.9%氯化钠注射液(四川科伦药业股份有限公司)；盐酸利多卡因注射液(浙江泰康药业集团有限公司)；水合氯醛(北京化学试剂厂)；大鼠5-HT、β-EP ELISA测定试剂盒(北京瑞格博科技有限公司)。

1.4 造模方法 运用陆志东[6]非压迫性腰椎间盘髓核突出模型造模方法。自体髓核混悬液的制备：术前1 d，大鼠背部用脱毛剂脱毛。10%水合氯醛0.35 mL/100 g腹腔麻醉，无菌条件下距尾根部1 cm处切下鼠尾并缝合伤口。切开尾部椎间盘，见髓核呈胶冻样约10 mg，取5个髓核，按每1 mg加入1 μL生理盐水配比，充分搅拌稀释成混悬液备用。模型组：将大鼠腰椎置于屈曲侧卧位，以L4～5棘突间隙为穿刺点，用9号腰椎穿刺针行硬膜外穿刺，成功后注射20 μL大鼠自体髓核混悬液，接着将2%利多卡因30 μL注射到硬膜外腔。假模型组：麻醉、断尾、硬膜外穿刺同实验组，不同的是将20 μL生理盐水和2%利多卡因30 μL注射到硬膜外腔。针刀组造模方法同模型组。

水合氯醛麻醉恢复后，大鼠四肢活动自如，说明硬膜外穿刺和注射失败。双前肢活动自如，双后肢运动、感觉丧失或减退，20～30 min后完全恢复，说明硬膜外穿刺注射成功。此时，可继续进一步观察其双下肢有无瘫痪(步态不稳或足外翻)以判定造模过程中是否对脊髓有损伤。若无瘫痪，则对其两侧后足进行热刺激痛觉过敏的检测，若热痛反应出现痛觉过敏，则提示造模成功。

1.5 处理方法 正常组正常饲养。假模型组：假造模后正常饲养。模型组造模后正常饲养。针刀组造模3 d后给予针刀干预。施针刀时首先用自制袜套将大鼠固定于鼠板上，以使其不能强烈挣扎为度。在L4～5棘间、L4～5棘间旁开0.1 cm处局部消毒,进行针刀操作，以大鼠下肢触电样抽动为度。每周治疗1次，共治疗1次。

1.6 取材 造模后第8天将各组大鼠分别固定于铡刀,在枕骨大孔水平断头处死。各组大鼠均采用断头后迅速倒置，离心管收集全血5 mL，4 ℃下静置3 h，置于离心机内离心(参数：4 ℃，3 500 rpm，10 min)，离心后取上清，放于-20 ℃冰箱中保存待测。

1.7 观察指标 1)行为学:从造模第1天开始观察记录大鼠有无烦躁、撕咬肢体、频繁的摇动尾巴、后肢或足突然自发抬起、用嘴反复舔后爪、食欲降低等。并与造模前后分别检测大鼠的热痛阈。2)后肢机械刺激缩爪阈值的变化：后肢机械刺激缩爪阈值的检测均选择在下午(13:00-18:00)，将各组大鼠放于PL-200型热痛测试仪的检测盒内，辐射热光源经底部玻璃板聚焦到一侧足底的后半部，光斑直径5 mm。记录从开始照射到产生缩爪的时间。每次测试间隔至少5 min，测量3次取平均值，两侧后足交替检测，根据平均值求出两后足热刺激缩爪潜伏期，按公式：术前潜伏期—术后潜伏期进行计算，差值大于正常大鼠组差值则表明潜伏期降低，对热痛反应存在痛觉过敏。3)血清中细胞因子的检测：采用双抗夹心ELISA法检测血清中5-羟色胺、β-内啡肽，操作步骤严格按试剂盒说明书进行。4)切片HE染色,显微镜观察照相。

2 结果

2.1 行为学 大鼠造模后活动减少，精神萎靡，多蜷缩于笼中一角，饮食、饮水较正常减少。自由活动时，行走速度变慢，步幅和频率减小，未出现撕咬肢体、频繁摇动尾巴、后肢或足突然自发抬起、用嘴反复舔后爪、食欲降低，而出现了易激惹、活动频繁的行为。

2.2 各组大鼠的热痛刺激缩爪阈值 见表1。造模前后各组大鼠缩爪时间差值比较,采用One-Way ANOVA，F=22.631，P=0.000,差异有统计学意义。模型组与其他各组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。

组 别造模前后缩爪时间差值正常组 0.63±0.35 假模型组0.72±0.50 模型组 2.70±0.64##△△针刀组 0.92±0.69▲▲

注：与正常组相比,##P<0.01；与假模型组相比,△△P<0.01;与模型组相比,▲▲P<0.01

2.3 针刀对腰突根性神经痛大鼠血清中5-HT和β-EP含量的影响 见表2。各组大鼠血清中5-HT含量的比较，采用One-Way ANOVA，F=3.238,P=0.020，差异有统计学意义。针刀组与模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.01);各组大鼠血清中β-EP含量的比较，采用One-Way ANOVA,F=3.696,P=0.011，差异有统计学意义。针刀组与模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。

表2 各组大鼠血清中5-HT、β-EP含量比较

注：与正常组相比,#P<0.05，##P<0.01；与假模型组相比,△P<0.05;与模型组相比,▲▲P<0.01

2.4 光镜观察 正常组(a)、假模型组(b)：神经组织结构致密、完整，有髓纤维的髓鞘完整、排列规则整齐，雪旺细胞大小均匀一致，数量较多，轴突表面规则完整，排列规则，无水肿；模型组(c):有髓纤维的髓鞘不完整，排列不规则，雪旺细胞数量减少，轴突边缘模糊，大小不规则，出现水肿变形，排列稀疏，胞质内出现明显的空泡；针刀组(d):与模型组相比，出现新生的髓鞘，髓鞘整体排列规则，大小基本一致，轴突无水肿，排列整齐，雪旺细胞大小一致。见图1。

图1 治疗后各组大鼠右侧L5神经根光镜观察结果

3 讨论

对于LDH的病因及发病机理,现阶段较为公认的原因是由于多种椎间盘突出引起的机械性压迫因素和(或)多种化学与免疫因素，包括多种化学性炎症介质、免疫性炎症介质及细胞因子(CK)及神经源性炎症介质在该病的发生中起重要作用[7],突出的椎间盘组织压迫神经根或神经根被牵伸是引起坐骨神经痛的原因，但是也发现许多病人髓核和神经根之间的接触并没有机械压迫，也有明显的腰腿痛，本实验所建立的动物模型及实验亦证实了这一点：将大鼠自体髓核移植到硬膜外腔，未出现运动障碍，排除了机械压迫因素后，大鼠活动频繁，易激惹，模型组大鼠造模前后热刺激缩爪时间差值明显高于正常组和假模型组(P<0.01,P<0.05),后肢出现明显的痛觉过敏反应，说明病理情况下髓核本身也能引起坐骨神经痛。组织形态学结果显示有髓神经纤维的脱髓鞘改变，空泡样变性等病理改变，表明髓核本身的自身免疫炎症反应是引起根性神经痛的可能因素之一。

5-羟色胺又叫血清素(serotonin),是色氨酸(Trp)的代谢产物，在人体中枢及外周组织中分布广泛。在外周5-HT系统中，5-HT是一种有很强烈致痛作用的外周致痛物质。当组织受损,血小板释放5-HT,在局部炎症中激活和敏化一些伤害性传入纤维,在外周疼痛的发生中发挥作用[8]。本研究结果显示，造模后模型组大鼠血清中5-HT的含量明显升高(P<0.01)，表明造模后由于髓核的免疫炎症反应促使机体释放5-HT等物质，引起了机体的痛觉过敏和痛反应。针刀干预后，血清中5-HT含量均较模型组显著降低(P<0.01)，说明针刀干预后,可减少外周5-HT的释放，减轻模型鼠的疼痛。这提示针刀疗法能显著改善腰椎间盘突出症根性神经痛的炎症反应，为临床治疗提供了实验依据。

研究表明，免疫细胞在炎性痛局部区域释放内源性阿片肽，它们与位于躯体感觉初级传入神经元的外周突及其末梢上的阿片受体结合，抑制神经元的兴奋性和兴奋性神经活性物质的释放，导致局部镇痛。各种内源性阿片肽都有镇痛作用，但作用性质不同。从内源性阿片肽的分类来看,β-EP有明显的镇痛效应[9]。其镇痛作用比吗啡强数十倍维持1 h以上，而脑啡肽的镇痛却远弱于吗啡，作用维持还不到10 min[10]。本实验结果显示，造模后，模型组大鼠血清中β-EP的含量较正常组显著升高(P<0.01),针刀组干预后，血清中β-EP含量均较模型组显著降低(P<0.05)，说明针刀干预后,可减少外周β-EP的释放，减轻模型鼠的疼痛。提示局部炎症本身可启动外周内源性阿片肽的释放，针刀疗法可通过调节外周β-EP的释放而起到镇痛作用。

针刀疗法是将针刺疗法和手术松解法有机地结合为一体，一方面利用针的作用，疏通气血、活血化瘀，“通则不痛”；另一方面利用刀的切割作用，松解黏连，解除卡压，“以松致通，通则不痛”。本实验证实，针刀疗法可直接作用于腰椎间盘突出症病变局部，松解局部的黏连和挛缩，改善局部循环，减轻炎症反应,并调节血清中5-HT和β-EP的含量而起到镇痛作用。

[1]鲍铁周,宋永伟.腰椎间盘突出症诊疗指南编写报告[J].世界中医骨科杂志,2011,12(1):22-23.

[2]全科.小针刀治疗腰椎间盘突出症临床观察[J].长春中医药大学学报,2012,28(3):499-500.

[3]赵春朋.臭氧与针刀技术结合保守治疗腰椎间盘突出症75例[J].长春中医药大学学报,2013,29(1):143-144.

[4]李建运.小针刀治疗腰椎间盘突出症14例[J].中国中医急症,2008,17(11):1620-1621.

[5]李成,刘艳玲.小针刀疗法治疗腰椎间盘突出症800例[J].现代中医药,2010,30(6):45-46.

[6]陆志东,金群华,陈志荣.大鼠非压迫性髓核突出模型的建立[J].中国矫形外科杂志,2003,11(19):1361-1363.

[7]Rannou F,Lee T S,Zhou R H,et al.Intervertebral disc degeneration:the role of the mitochondrial pathway in annulus fibrosus cell apoptosis induced by overload[J].Am J Patbol,2004,164(3):915-924.

[8]冀海明,洪炎国.5-羟色胺2A受体与疼痛[J].国际病理科学与临床杂志,2007,27(5):456.

[9]Millan.M J.Descending control of pain[J].ProgNeurobjol,2002,66(6):355-474.

[10]张安中,孙凤艳.内啡肽系统与针刺镇痛[J].上海第一医学院学报,1978,1(1):67-78.