林蛙油中激素类成分的GC-MS分析

肖井雷，康 岚，朱键勋，姜大成

(长春中医药大学，长春 130117)

林蛙油为中国林蛙(RanatemporariachensinensisDavid)雌蛙的干燥输卵管，又称哈蟆油，是一种药食同源的珍贵佳品[1]。气质联用法(GC-MC)被广泛应用于复杂样品的定性定量鉴别，其方法具有灵敏度高、速度快、时间短、精密度高及效能高等特点。激素类成分在临床中广泛使用，尤其是雌激素类成分可以在妇女进入绝经期后升高体内的雌激素水平，用来预防或治疗妇女更年期综合症等疾病[2]。本实验利用GC/MS方法对林蛙油中激素类成分进行定性定量分析。

1 仪器与试剂

QP2010 GC-M气质联用仪(日本岛津), 配不分流毛细管柱进样器及GC/MS化学工作站；HH-4数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)；DT5-2型低速台式离心机(北京时代北利离心机有限公司)；FA10048电子天平(上海佑科有限公司)。氯仿(分析纯)，乙腈(分析纯)，石油醚(分析纯)，甲醇(分析纯)，氯化钠，无水硫酸钠等。林蛙油为自行剥取的林蛙输卵管，林蛙采购于吉林省抚松县，干燥后备用，本品经长春中医药大学中药鉴定教研室姜大成教授鉴定为中国林蛙(RanatemporariachensinensisDavid)雌蛙的输卵管。

2 实验方法

2.1 林蛙油供试品溶液的制备 准确称取林蛙油粉末试样2.0 g，加入0.5 g氯化钠，加15 mL氯仿和5 mL水，匀浆1 min后，超声30 min，置于离心机中5 000 r/min离心10 min,上层水液弃去，取氯仿层，再次加入氯仿和水重复1次。合并氯仿层,加入适量无水硫酸钠去除水分，过滤于蒸发皿中，挥干氯仿，用10 mL乙腈溶解至离心管中，加入3 mL石油醚混匀后，3 000 r/min离心2 min，弃去石油醚层，重复一次至下层无色，于65 ℃水浴蒸干，加2 mL甲醇混匀，即得[3-4]。

2.2 GC-MS的测定条件 气相色谱条件：DB-5 MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 mm)；He载气(≥99.999%)；柱压60.2 Pa；载气恒线速度37.2 cm/s；不分流进样0.2 μL；进样口温度为250 ℃。色谱柱升温程序：初始温度120 ℃，保留2 min，以15 ℃/min升至250 ℃，保留2 min，以5 ℃/min升至300 ℃，保留5 min[5-6]。

质谱条件：电子能量70 eV；灯丝电流65 μA；检测电压1 102 V；EI源温度230 ℃；接口温度280 ℃；溶剂延迟时间3 min[6]。

3 结果与讨论

将林蛙油供试品溶液按上述色谱条件进样，从林蛙油供试品溶液中共鉴定出5个化合物，通过NIST及SADITE谱图库检索对这5个化合物进行鉴别，并利用峰面积归一法对5个化合物进行了相对含量的测定，气质谱图见图1，分析结果见表1。

表1 林蛙油供试品溶液化学成分及相对含量

图1 林蛙油供试品溶液气质色谱图

由表1可知，初步分析得到5种激素类成分，其中除胆固醇(峰4号)和雌二醇(峰5号)在其他文献中报道过[7-8]，乙酸雄甾酮(峰1号)、前列腺素(峰2号)及美屈孕酮(峰3号)均为首次从林蛙油供试品中分离得到。已有研究表明激素类成分对人类健康可能是一把“双刃剑”，长期应用雌激素易产生高血压、水肿等副作用，因此应当加强对其安全性的研究[9]。

[1]王红燕,徐绥绪.哈蟆油化学成分与药理研究概况[J].中成药,1998,20(9):39.

[2]Yusuf S,Anand S.Hormone replacement therapy:a time for pause[J].Can Med Assoc J,2002,167(4):329.

[3]王春霖.哈士蟆油甾体激素定量分析及药理作用[J].中药通报,1985,10(2):44.

[4]徐英江,田秀慧,张秀珍,等.超高液相色谱串联质谱法对水产品8种雌激素的测定[J].分析测试学报,2010,29(2):152-156.

[5]王玉飞,周凯,李继革.GC/MS/MS法同时测定海产品中四种雌激素残留[J].中国卫生检验杂志,2006,26(1):21-23.

[6]邹龙,林洪,江洁.氘代同位素内标气相色谱-质谱法测定鱼贝类肌肉中β-雌二醇残留[J].分析化学研究报告,2007,35(7):983-987.

[7]陈燕超,胡岩,王试涵,等.GC-MS法对蛤蟆油中甾体类化合物的分析[J].长春中医药大学学报,2010,26(5):660-661.

[8]刘娟,刘爽,刘程诚.高效液相色谱法测定蛤蟆油中雌二醇的含量[J].辽宁中医杂志,2010,38(1):138-139.

[9]Kenji Takakura,K.T.,Wang Huaqin.Follicle-stimulating hormone receptor gene mutations are rare in Japanese women with premature ovarian failure and polycystic ovary syndrome [J].Fertility and Sterility,2001,75(1):207-209.