应用微卫星PCR技术鉴别中国林蛙

蔡广知，郑 丹，张彦飞，贡济宇

(长春中医药大学，长春 130117)

微卫星DNA指纹图谱(microsatellite，MS)又称为短串联重复(short tandem repeats，STR)或简单序列重复(simple sequnce repeat，SSR)，是基因组中一段由几十个核苷酸组成的序列，此序列一般由几个核苷酸(一般为2～4个)为单位多次串联重复组成[1-2]。其中以双核苷酸重复最为常见，真核生物的基因组中有大量的微卫星DNA存在,约每隔10～550 kb就存在一个微卫星。微卫星DNA由于具有特异性的PCR扩增、多态信息容量高、引物通用性好、突变率高、共显性等特点[3-4]。本文采用微卫星鉴别技术，对长白山、黑龙江伊春、辽宁抚顺、吉林四海林场4个地区的林蛙开展了鉴别研究。

1 材料

1.1 仪器 1110型PCR仪(美国Bio-Rad公司);TGL型台式高速离心机(湖南星科科学仪器有限公司)；Dolphin-Doc凝胶成像分析仪(美国wealtec公司);JY-SP10水平电泳槽(杭州汇尔仪器公司)；电泳仪(美国Bio-Rad公司)；微型离心机(北京六一仪器有限公司)；PCF型超纯水机(成都品成科技有限公司)。

1.2 试剂及耗材 DL500 Marker购自宝生物工程有限公司；荧光染料(EB)和单染料购于天根生化科技有限公司；50XTAE缓冲液和琼脂糖均购自上海生工生物工程有限公司；PCR mix(英杰生命科技有限公司);DNA提取试剂盒编号SK-8222和动物组织快速直接PCR试剂盒均购自上海生工生物工程有限公司。

2 方法

2.1 PCR的反应体系 PCR反应体系为25 μL:PCR反应液为12.5 μL(1 x),模板为0.5 μL(0.1～10 ng)，引物为上下游引物各1 μL(0.4 μmol/L)，超纯水10 μL，PCR反应程序以正品长白山野生林蛙为模板。

2.2 PCR反应程序 95 ℃预变性5 min；95 ℃变性50 s；46～60 ℃退火50 s；72 ℃延伸90 s；共35个循环；最后72 ℃延伸5 min；8 ℃保存。

2.3 特异性鉴别引物的筛选 根据GenBank发表的中国林蛙的基因序列,以及国内外文献的报道，选出11对微卫星引物作为本实验的引物，最终有5对能够稳定扩增：

引物1：RCMS035 F:AATGGCGAGGAGGTTGACTA

EU377559 R:GCAGTGTTTTATCGCTCGGT

引物2：RCMS042 F:TCTAGCCAGCAGGTAAAACTC

EU377560 R:GAAGTTTGTTCTATTGACCTCTGT

引物3：RCMS092 F:CAAAAGCAGATGGCTGGATAC

EU377562 R:GCTCTATGATAGTGCGTGAAGG

引物4：RCMS029 F:CTATGGACAGAGCAGAAAGAC5

EU377556 R:GCATCTGCTGGTTGGGTAGTG

引物5：RCMS030 F:ACAGGGCAGGACATCTCAGC

EU377557 R:GCATGGGACAAGATACTGGC

3 结果

3.1 5引物对不同地区林蛙的PCR电泳图谱分析

3.1.1 引物1的PCR电泳图谱分析 提取4种林蛙DNA模板，加入引物1，退火温度为52.8 ℃，模板浓度为0.5 μL，循环次数为35个循环，扩增产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳电压为120 V，电泳时间为35 min，上样量为0.5 μL，在全自动凝胶成像分析系统上观察和分析。由扩增后的电泳图可以看出，长白山林蛙在240 bp左右有明显的扩增条带，黑龙江伊春的林蛙在200 bp处有明显的扩增条带，辽宁抚顺林蛙在179 bp处有明显的扩增条带，吉林四海林场林蛙在220 bp处有明显的扩增条带。

3.1.2 引物2的PCR电泳图谱分析 提取4种林蛙DNA模板，加入引物2,退火温度为55 ℃，后续操作同引物1。结果表明，长白山林蛙在120 bp左右有明显的扩增条带,黑龙江伊春的林蛙在165 bp处有明显的扩增条带，辽宁抚顺林蛙在135 bp处有明显的扩增条带，吉林四海林场林蛙在150 bp处有明显的扩增条带。

3.1.3 引物3的PCR电泳图谱分析 提取4种林蛙DNA模板，加入引物3进行扩增，其退火温度为57 ℃，后续操作同引物1。结果表明，长白山林蛙在200 bp左右有明显的扩增条带，黑龙江伊春的林蛙在150 bp处有明显的扩增条带，辽宁抚顺林蛙在190 bp处有明显的扩增条带，吉林四海林场林蛙在230 bp处有明显的扩增条带。

3.1.4 引物4的PCR电泳图谱分析 提取4种林蛙DNA模板，加入引物4进行扩增，其退火温度为57 ℃，后续操作同引物1。结果表明，长白山林蛙在280 bp左右有明显的扩增条带，黑龙江伊春的林蛙在180 bp处有明显的扩增条带，辽宁抚顺林蛙在210 bp处有明显的扩增条带，吉林四海林场林蛙在245 bp处有明显的扩增条带。

3.1.5 引物5的PCR电泳图谱分析 提取4种林蛙DNA模板，加入引物5进行扩增，其退火温度为55 ℃，后续操作同引物1。结果表明，长白山林蛙在280 bp左右有明显的扩增条带，黑龙江伊春的林蛙在180 bp处有明显的扩增条带，辽宁抚顺林蛙在200 bp处有明显的扩增条带，吉林四海林场林蛙在300 bp处有明显的扩增条带。

3.2 微卫星等位基因分型 对上述5对引物的正向引物5’端用荧光标记进行修饰，分别进行40只林蛙样本的动物DNA提取，根据上述PCR条件进行等位基因扩增。PCR产物应用ABI 3730自动测序仪分型进行等位基因测试；并用GeneMapper ID v3.2软件对等位基因进行判读。对每对引物扩增产物的等位基因做频数分布图。结果见图1～5。

图1 引物1的基因频数分布图

图2 引物2的基因频数分布图

图3 引物3的基因频数分布图

图4 引物4的基因频数分布图

图5 引物5的基因频数分布图

由等位基因图可看出，等位基因的扩增结果与琼脂糖电泳的电泳结果无明显差异，其片段大小均上下浮动在16bp 左右,表明这种方法准确可靠。中国林蛙长白山亚种与其它地区林蛙的等位基因片段大小频次分布不一样，基因片段大小差异比较大，有利于中国林蛙长白山亚种与其他种属林蛙的区分。

4 讨论

采用5种微卫星引物对中国林蛙长白山亚种、黑龙江伊春林蛙、辽宁桓仁林蛙以及吉林四海林场林蛙进行PCR扩增和分析。由5对引物的PCR扩增结果可知，在琼脂糖电泳图中,每种引物均可以鉴别4种不同产区的林蛙。为使实验结果更准确,采用荧光标记的方法进行等位基因扩增，进一步验证了微卫星鉴别方法的准确性和可靠性。

微卫星PCR结果虽有差异，但5种引物的扩增片段大小差异并不大，实际应用中可采用多种引物分别进行鉴别,综合多引物扩增片段的结果来评价和鉴别。每个物种的不同引物PCR扩增片段的大小均不相同，增加引物进行研究可以提高鉴别的精准度，今后可考虑大量筛选微卫星引物，增加选取样品的品种和数量，筛选具有更高特异性的微卫星引物[5-7]。

[1]Yang W,Qi Y,Bi K,et al.Toward understanding the genetic basis of adaptation to high-elevation life in poikilothermic species:a comparative transcriptomic analysis of two ranid frogs,Rana chensinensis and R.kukunoris[J].BMC Genomics,2012(1):583-588.

[2]Zhao J,Sun Y,Li Z,et al.Molecular cloning of novel antimicrobial peptide genes from the skin of the Chinese brown frog,Rana chensinensis[J].Zoolog Sci,2011,28(2):112-117.

[3]Zhang H,Wu Q.Studies on the multiple gene system and gene linkage of lactate dehydrogenase in Rana chensinensis[J].Yi Chuan Xue Bao,1996,23(1):11-17.

[4]Fushimi H,Komatsu K,Isobe M,et al.A new approach for the identification of a Chinese traditional medicine “Chuan xiong” by 18S ribosomal RNA sequences[J].Phytomedicine,1997,3(4):387-389.

[5]詹立平,赵鑫,刘志梅.基于PCR技术的现代分子生物学操作在中药鉴定中的应用[J].中国医药商报,2013,10(7):12-15.

[6]李力,徐永莉,张月云,等.DNA分子标记在中药鉴定中的应用及发展趋势分析[J].时珍国医国药,2009,20(11):23.

[7]王乐,李素霞,陈晶.中药指纹图谱在中药质量控制中的应用[J].河北化工,2010,33(1):34-36.