应用细菌磁颗粒real-timeRT-PCR检测百合无症病毒

邓丛良，双龙海，孙 宁,2，陈继峰，魏海燕

(1.北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心，北京 101312； 2.东南大学生物科学与医学工程学院，南京 210096； 3.郑州大学生物工程系，郑州 450001)

应用细菌磁颗粒real-timeRT-PCR检测百合无症病毒

邓丛良1*，双龙海1，孙 宁1,2，陈继峰3，魏海燕1

(1.北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心，北京 101312； 2.东南大学生物科学与医学工程学院，南京 210096； 3.郑州大学生物工程系，郑州 450001)

为研究细菌磁颗粒分离提取不同样本材料中的植物病毒RNA的效果，以及结合实时荧光 RT-PCR技术检测LSV的灵敏性，选取感染病毒的西葫芦叶片(CGMMV和SqMV)、大豆种子(BPMV)与百合叶片(LSV和ArMV)3种样本材料，利用细菌磁颗粒分别提取这5种病毒RNA，与Trizol方法提取效果进行比较，同时与Trizol real-time RT-PCR检测LSV的灵敏度进行了比较。结果表明：BMPs方法能够从3种植物样本中提取病毒RNA，其检测LSV的灵敏性与Trizol方法相当。

细菌磁颗粒； 实时荧光 RT-PCR； 灵敏度

纳米材料是指在三维空间上至少有一维在0～100nm以内或者以此为基本结构单元而组成的材料，其具有小尺寸效应，量子效应，以及比表面积大等特性[1]。磁性纳米颗粒是一种单磁畴的纳米粒子，只有当处于外部磁场中才会显现出磁性，而且由于其尺寸小、比表面积大，能够与靶标物充分的结合，是用于固相分离的良好介质[2]。细菌磁颗粒是一种分离自趋磁细菌的生物纳米磁性颗粒，具有良好的生物相容性，表面主要由磷脂酰乙醇胺与磷脂酰甘油组成的磷脂膜包裹，表面分布有游离的氨基，能够进行通过物理吸附或借助化学偶联剂与功能生物分子或药物相连，可用于治疗、诊断以及检测等方面的应用[3-6]。

植物病毒的检测方法主要有鉴别寄主、血清学、电镜观察和分子生物学[7]。鉴别寄主方法虽然能够对病毒感染植物症状更直观的观察，但很难对病毒的种属进行准确鉴定；DAS-ELISA是目前最为常用植物病毒检测方法，但是这种方法依靠高灵敏性的血清，否则容易造成假阴性；电镜观察的制样较为复杂，而且对病毒检测来说，也容易受到电镜视野的限制；分子生物学方法，主要是通过分子杂交、扩增等技术对病毒核酸进行分析，具有灵敏度高，特异性好的优点，但是对于从复杂的植物样本材料中提取病毒核酸，特别大多为RNA时，目前常用的提取技术，如利用有机溶剂(苯酚、氯仿等)抽提，具有耗时长、对操作人员身体易造成伤害等缺点。因此，必须发展新型的植物病毒提取技术。

近年来，采用化学合成的磁性纳米颗粒在富集提取核酸方面，展现出非常巨大的优势。相比于化学合成的，细菌磁颗粒生物相容性与均一性更为优良。因此，本文利用纳米级细菌磁颗粒(bacterial magnetic particles，BMPs)比表面积大，分散性好，与病毒粒子非特异结合的特性，分别对感染黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus,CGMMV)和南瓜花叶病毒(Squashmosaicvirus，SqMV)的西葫芦叶片，感染菜豆荚斑驳病毒(Beanpodmottlevirus，BPMV)的大豆种子，感染百合无症病毒(Lilysymptomlessvirus,LSV)与南芥菜花叶病毒(Arabismosaicvirus,ArMV)的百合叶片这3种植物样本材料进行病毒核酸提取，结合实时荧光RT-PCR技术进行检测，验证其对不同样本材料提取的可靠性，同时对细菌磁颗粒实时荧光RT-PCR技术检测LSV的灵敏性与常用的Trizol试剂方法进行了比较分析。

1 材料与方法

1.1 材料

携带CGMMV和SqMV的西葫芦叶片、携带BPMV的大豆种子、携带LSV和ArMV的百合叶片以及相应的阴性材料均由本实验室保存。Trizol试剂购自Invitrogen公司，M-MLV反转录酶和实时荧光PCR试剂盒均购自TaKaRa公司。细菌磁颗粒由郑州大学陈继峰博士提供。Real-time RT-PCR引物与探针见表1。

表1Real-timeRT-PCR引物与探针

Table1Primersandprobesforreal-timeRT-PCR

病毒Virus引物与探针Primerandprobe序列Sequence(5′⁃3′)CGMMV上游引物(Senseprimer)5′⁃GCGGGTTTTTACGCTTTCC⁃3′下游引物(Anti⁃senseprimer)5′⁃CGTATCCGTGGAGCTGAGAAG⁃3′探针(Probe)5′⁃FAM⁃ACGGTCCTGTGTTGAGGCCTATCTTCG⁃BHQ1⁃3′SqMV上游引物(Senseprimer)5′⁃CGCACCCATGTTATAAGAGGC⁃3′下游引物(Anti⁃senseprimer)SqMV⁃RP5′⁃ATAGCCAAAGCACAACCTGTATT⁃3′探针(Probe)5′⁃FAM⁃ACGCTGTGTTGCTTCTATCAATGTTCCA⁃BHQ1⁃3′BPMV上游引物(Senseprimer)5′⁃CTCTCCTTACATTAAATGTACAGTGTCTT⁃3′下游引物(Anti⁃senseprimer)5′⁃AACTTATTCCTGAATTTCTCCAAACT⁃3′探针(Probe)5′⁃FAM⁃TTCATAGCATTTGGAAATTTGGCTGATGA⁃BHQ1⁃3′LSV上游引物(Senseprimer)5′⁃CCCCTACGGGAGATTCTCAA⁃3′下游引物(Anti⁃senseprimer)5′⁃GGTTGCCATGTTGTTAGATACGA⁃3′探针(Probe)5′⁃FAM⁃TGACGAACTCTTCAAGATGAAGGTTGGC⁃BHQ1⁃3′ArMV上游引物(Senseprimer)5′⁃GCACTGTAGCCCTTGGAGATAATCC⁃3′下游引物(Anti⁃senseprimer)5′⁃CCCTCCAAATCCCACATTAACTTA⁃3′探针(Probe)5′⁃FAM⁃CTCACATGATAGCTTGTCATGGACTCC⁃TAMRA⁃3′

1.2 病毒RNA提取

称取样本材料各100mg，分别利用Trizol方法与BMPs方法提取病毒RNA。Trizol方法参考试剂说明进行提取，称取100mg样本材料，将最后获得的沉淀溶于500μL RNase Free water。BMPs方法参考文献[5-6]，同样称取100mg样本材料，加入1mL研磨缓冲液，离心后取100μL上清液，利用BMPs分离病毒粒子，加入50μL RNase free water，95 ℃孵育5 min，释放病毒RNA。

1.3 BMPs real-time RT-PCR检测

利用BMPs方法分别提取携带CGMMV和SqMV的西葫芦叶片、携带BPMV的大豆种子以及携带LSV和ArMV的百合叶片的RNA，然后进行实时荧光RT-PCR检测，以Trizol方法提取阳性与阴性样本RNA作为阳性与阴性对照。

1.4 灵敏性比较

分别取100mg含LSV的阴性与阳性百合叶片组织，加入1mL研磨缓冲液进行研磨，离心，取20μL阳性材料上清液，利用阴性材料上清液进行梯度稀释，稀释倍数为10n(n=1、2、3……6)，分别利用BMPs方法与Trizol方法提取病毒RNA，通过real-time RT-PCR进行检测，比较两者的灵敏性。

1.5 Real-time RT-PCR

在200μL离心管中加入5 μL RNA与1μL下游引物(10μmol/L)，70℃水浴10min，立即置于冰上2 min，而后依次加入2 μL 5×M-MLV Buffer，0.5 μL dNTP Mixture(10mmol/L)，0.25 μL M-MLV(200U/μL)，0.25 μL RNase Inhibitors(40U/μL)，补足无RNase free water至10μL，42 ℃温育60min，70℃ 10min灭活反转录酶，冰上放置2 min。

在一个洁净的200μL离心管中依次加入2 μL反转录产物、10μL Premix ExTaq(2×)、上游引物(10μmol/L)和下游引物(10μmol/L)各0.4 μL、0.2 μL探针(10μmol/L)，补足去离子水至20μL。扩增程序：95 ℃ 10s；95 ℃ 5 s，60℃ 20s，40个循环。

2 结果与分析

2.1 BMPs real-time RT-PCR检测

图1为利用BMPs方法分别提取西葫芦叶片组织(CGMMV与SqMV)、大豆种子(BPMV)与百合叶片(LSV与ArMV)3种不同样本材料中的病毒RNA进行real-time RT-PCR检测的扩增曲线。从相对荧光强度(ΔRn)对循环数(cycle)的扩增曲线可以看到，BMPs方法能够准确的分别从3种样本材料中提取出病毒RNA，随循环数的增大，ΔRn升高，均扩增曲线，而阴性材料的均有没有扩增，与Trizol real-time RT-PCR检测结果一致，检测CT值见表2。

图1 Real-time RT-PCR检测Fig.1 Real-time RT-PCR detection

表2Real-timeRT-PCR检测CT

Table2CTvaluesofreal-timeRT-PCRdetection

样本材料Sample病毒VirusBMPsreal⁃timeRT⁃PCR(CT)阳性Positive阴性NegativeTrizolreal⁃timeRT⁃PCR(CT)阳性Positive阴性Negative西葫芦叶片ZucchinileavesCGMMVSqMV22．6520．46404020．7817．954040大豆种子SoybeanseedsBPMV36．574032．5240百合叶片LilyleavesLSVArMV29．2335．35404027．8534．914040

2.2 BMPs real-time RT-PCR检测LSV灵敏性

BMPs real-time RT-PCR检测LSV如图2，CT值随稀释梯度的增大而增大，当稀释梯度为10-6时，扩增没结果没有超过阈值，其CT值为40，各梯度检测CT值依次为22.65、25.31、28.48、31.45、34.68、40，其阴性对照CT为40。结果表明：BMPs real-time RT-PCR检测LSV的稀释限点为10-5。

2.3 Trizol real-time RT-PCR检测LSV灵敏性

图3为Trizol real-time RT-PCR检测LSV灵敏性结果。从图中可以看到，随着阳性材料稀释倍数的增大，检测CT值依次增大，当稀释梯度为10-6时，相对荧光强度(ΔRn)没有超过阈值，其CT值依次为20.97、23.27、28.66、33.54、37.77、40，阴性对照曲线没有扩增(CT=40)。结果表明：Trizol real-time RT-PCR检测LSV稀释限点为10-5。

图2 BMPs-based real-time RT-PCR检测灵敏性Fig.2 Sensitivity of BMPs-based real-time RT-PCR detection

图3 Trizol real-time RT-PCR检测灵敏性Fig.3 Sensitivity of Trizol-based real-time RT-PCR detection

3 讨论

本研究利用细菌磁颗粒(BMPs)提取了多种样本材料中的植物病毒RNA，并结合real-time RT-PCR技术对病毒进行了检测。对于不同的样本材料(西葫芦叶片、大豆种子和百合叶片)均具有很好的提取和检测效果。但是，BMPs方法提取的病毒核酸的浓度要低于Trizol试剂(real-timeRT-PCR的CT)，尤其是对于大豆种子材料，其CT值要高大约3个CT值，这表明其核酸浓度要低近10倍。这可能是由于大豆种子丰富的蛋白质占据了病毒粒子的吸附位点，造成病毒核的提取量比较低。同时，相比于大豆种子材料，叶片材料病毒核酸的提取效果与Trizol试剂相差不多。

此外，对于检测百合叶片LSV的灵敏性进行了测定，并与Trizol real-time RT-PCR检测百合叶片LSV的灵敏性相比，具有相同的检测灵敏性，表明该检测方法具有很好的灵敏性。

细菌磁颗粒(BMPs)具有良好的生物相容性，同时由于表面分布有游离的氨基，造成粒子之间相互排斥，在水溶液中分散性好，当与样本溶液混合时，能够与病毒粒子发生相互作用，利用外加磁场，将BMPs与病毒的复合物从样本溶液中分离出来。本实验室通过研究建立了提取植物病毒RNA的BMPs方法，并将此方法与实时荧光RT-PCR技术相结合，应用于检测多种植物病毒，此方法具有以下三个优点：1)特异性好，实时荧光RT-PCR技术具有灵敏性好，特异性高；2)操作简单，耗时短；3)不需要使用有机溶剂，避免对操作人员健康带来损伤。

[1] 沈海军.纳米科技概论[M].北京: 国防工业出版社,2007.

[2] Käppler T E,Hickstein B,Peuker U A,et al.Characterization of magnetic ion-exchange composites for protein separation from biosuspensions[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2008,105(6): 579-585.

[3] Chen J F,Li Y,Wang Z F,et al.High-sensitivity detection of fruit tree viruses using bacterial magnetic particles[J].Journal of Integrative Plant Biology,2009,51(4): 409-413.

[4] Schüler D,Frankel R B.Bacterial magnetosomes: microbiology,biomineralization and biotechnological applications[J].Applied Microbiology Biotechnology,1999,52: 464-473.

[5] 孙宁,邓丛良,么磊,等.应用细菌磁颗粒实时荧光RT-PCR检测南瓜花叶病毒[J].植物病理学报,2010,40(6): 632-635.

[6] 孙宁,张一折,陈继峰，等.应用细菌磁颗粒RT-PCR检测3种植物病毒[J].植物检疫,2010,24(6): 16-19.

[7] 邓丛良,江明,汪万春，等.应用MNP-RT-PCR方法检测黄瓜绿斑驳花叶病毒[J].植物病理学报,2008,38(4): 436-440.

Applicationofbacterialmagneticparticle-basedreal-timeRT-PCRfordetectingLilysymptomlessvirus

Deng Congliang1, Shuang Longhai1, Sun Ning1,2, Chen Jifeng3，Wei Haiyan1

(1.TestingCenterofBeijingInspectionandQuarantineBureau,Beijing101312,China; 2.CollegeofBiologicalandMedicalEngineering,SoutheastUniversity,Nanjing210096,China; 3.DepartmentofBioengineering,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

To evaluate the effectiveness of the BMPs-based method,which was used for extracting plant viral RNAs from different samples,cucurbita pepo leaves (infected by CGMMV or SqMV),soybean seeds (infected by BPMV),and lily leaves (infected by LSV or ArMV) were extracted by BMPs-based real-time RT-PCR.The effectiveness and sensitivity of BMPs-based real-time RT-PCR were compared with that of the Trizol-based method.The results indicated that the BMPs-based method was effective for separating and extracting plant viral RNAs,and the sensitivity for detecting LSV using BMPs-based real-time RT-PCR equals that of the Trizol-based real-time RT-PCR.

bacterial magnetic particles (BMPs); real time RT-PCR; sensitivity

2013-02-22

：2013-10-16

公益性行业(质检)科研专项(201110035)；国家质检总局科技计划项目(2010IK179)

S 432.41

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.018

* 通信作者 E-mail: dengcl@bjciq.gov.cn