急性缺氧肺动脉平滑肌细胞线粒体活性氧变化的观察*

杨 朝， 耑 冰， 张丽萍， 赵 霞， 张建银， 葛利军， 吴昌归

(宁夏人民医院 1总院呼吸内科， 2心血管内科，宁夏 银川 750011； 3第四军医大学西京医院呼吸内科，陕西 西安 710000)

缺氧时选择性收缩肺动脉对于调节动脉氧合作用非常重要，然而，在机体整个处于缺氧状态下，如呼吸系统疾病或高原缺氧等，缺氧肺血管收缩(hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV)导致肺动脉压力异常增高，长期反复发生可以形成或加剧肺动脉高压(pulmonary hypertension)的发生发展[1]。目前HPV发病的分子机制，如肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs) 哪个部位感知缺氧、缺氧信息如何转导最后导致肺动脉收缩还不十分清楚。多数研究认为PASMCs线粒体感知缺氧并始动了HPV的发生[2-3]，线粒体产生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，主要是过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)在传递缺氧信息中起着重要的作用，但线粒体在缺氧时产生ROS的位点还不很清楚。Michelakis等[4]研究认为缺氧可以引起线粒体电子传递链(electron transport chain，ETC)复合物I及III位点产生ROS减少从而导致HPV，而更多研究认为线粒体ETC复合物I、II、III和IV均与HPV有关[5-6]。因此，本研究通过激光扫描共聚焦显微镜观察缺氧时PASMCs 产生ROS的变化，同时直接分离线粒体，用荧光分光光度法检测其生成量及生成的具体位点。

材 料 和 方 法

1 动物和试剂

健康成年雄性SD 大鼠体重(200±15) g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，自由进食饮水；DMEM、胎牛血清 (fetal bovine serum，FBS)青、链霉素均为Gibco产品；二硫苏糖醇 和4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸 [4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid, HEPES] 购自Roche；α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)单克隆抗体购自Abcam；生物素化山羊抗小鼠IgG购自Santa Cruz；SABC试剂与DAB显色剂购自Pierce；胶原酶I、分子探针chloromethyl dichlorodihydrofluorescein diacetate(CM-H2DCF/DA)和RedoxSensor Red CC-1、线粒体ETC复合物I抑制剂1-methyl-4-phenylpyridinium iodide (MPP，5 μmol/L)、复合物II抑制剂3-nitroproprionic acid (NPA，5 mmol/L) 及2-tenoyltrifluoroacetone (TTFA, 10 μmol/L)、复合物III前泛半醌位点抑制剂myxothiazol (10 μmol/L)、复合物III后泛半醌位点抑制剂antimycin A (5.7 μmol/L)和复合物IV抑制剂sodium azide (NaN3，1 mmol/L)、呼吸缓冲液[包括5 mmol/L丙酮酸(pyruvate)、2.5 mmol/L苹果酸(malate)、10 μmol/L dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCF/DA; 分子探针) 和5 μmol/L辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)] 均购自Sigma；细胞线粒体分离试剂盒购自碧云天公司；其余试剂为国产分析纯。

2 大鼠PASMCs分离、培养、鉴定和分组

参照我实验室既往方法[7]分离及培养PASMCs，经平滑肌α-actin单克隆抗体免疫细胞化学染色鉴定为平滑肌细胞。

实验分8组：(1) 常氧组；(2)急性缺氧组；(3)急性缺氧+线粒体ETC复合物I抑制剂MPP组；(4)急性缺氧+线粒体ETC复合物II抑制剂NPA组；(5)急性缺氧+线粒体ETC复合物II抑制剂TTFA组；(6)急性缺氧+线粒体ETC复合物III前泛半醌位点抑制剂myxothiazol组；(7)急性缺氧+线粒体ETC复合物III后泛半醌位点抑制剂antimycin A组；(8)急性缺氧+线粒体ETC复合物IV抑制剂NaN3组。

常氧的实验条件为：35 ℃，21% O2，5% CO2，74% N2；急性缺氧的实验条件为：35 ℃， 1% O2，5% CO2，94% N2，持续5 min[8]。

3 细胞内ROS的检测

4 线粒体的分离

参照Korde等[3]的方法分离线粒体，取生长良好的PASMCs，胰酶消化并收集细胞后用预冷的PBS重悬细胞沉淀，取少量细胞计数，剩余细胞500×g、4 ℃离心5 min，弃上清。每(2～5)×107细胞中加入1～2.5 mL线粒体分离试剂(根据细胞样品数量，在线粒体分离试剂加入到细胞样品中前2～3 min内加入蛋白酶抑制剂PMSF，使PMSF的终浓度为1 mmol/L)，重悬细胞，冰浴10～15 min。把细胞悬液转移至玻璃匀浆器中匀浆30下，然后将细胞匀浆在1 300×g、4 ℃离心3 min，取上清，沉淀用同样方法再进行1次，再取上清。将获得的上清液在13 000×g、4 ℃离心10 min, 弃上清，沉淀用线粒体分离试剂(已加入PMSF)重悬，再在10 000×g、4 ℃离心10 min，弃上清，得到沉淀即为线粒体，用150～200 μL 线粒体储存液重悬线粒体待用。所有步骤均在冰上或4 ℃进行，所用溶液均冰浴或4 ℃预冷。

5 线粒体ROS的检测

参照Korde等[3]的方法测定线粒体ROS。取线粒体悬液加入96孔板，每孔线粒体蛋白浓度测定约为50 μg ，加入呼吸缓冲液(5 mmol/L 丙酮酸，2.5 mmol/L 苹果酸，10 μmol/L H2DCF/DA及5 μmol/L HRP)，室温孵育30 min，用FlexStation-III分光光度计(Molecular Devices)检测荧光强度，激发波长485 nm，发射波长532 nm. 在每一实验中，ROS的量根据测定量减去背景荧光强度(只加入呼吸缓冲液而无线粒体样本时测得的荧光强度)。

6 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，成组资料的比较用t检验，多组资料的比较采用F检验，组间差异采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。以P<0.05为差异有统计学意义。用SPSS 13.0软件包处理。

结 果

1 肺动脉平滑肌细胞的鉴定

生长中的PASMCs见图1A。经α-SMA免疫细胞化学染色，在高倍镜下可见α-SMA在胞质内均匀分布，呈棕色平行纤维丝状结构，见图1B。

Figure 1. The growth of PASMCs (A, ×300) and the positive expression of α-smooth muscle actin in PASMCs(B,×300).

2 常氧及急性缺氧肺动脉平滑肌细胞 ROS的生成量

3 常氧及急性缺氧PASMCs 中ROS 的生成量及生成位点

(1) 与常氧组比较，急性缺氧PASMCs ROS(主要是H2O2)的生成量增加了3.44倍(P<0.01)。(2) 与缺氧组比较，使用线粒体ETC复合物I抑制剂MPP(5 μmol/L)、复合物II抑制剂NPA(5 mmol/L) 和TTFA(10 μmol/L)及复合物III前泛半醌位点抑制剂myxothiazol (10 μmol/L)，都能显著降低缺氧时PASMCs胞内ROS的生成量 (分别降低60%、73%、75%和61%，P<0.01)；而复合物III后泛半醌位点抑制剂antimycin A (5.7 μmol/L) 及复合物IV 抑制剂NaN3(1 mmol/L) 对胞内ROS的生成量无明显影响(升高13%和9.1%，P>0.05)，见图3。这提示急性缺氧时PASMCs线粒体复合物Ⅰ、Ⅱ以及III前泛半醌位点生成ROS增加，而III后泛半醌位点和IV与此无明显关系。

Figure 2. ROS production in the rat PASMCs under the conditions of normoxia and hypoxia. A: H2O2 concentration-dependently increased DCF fluorescence intensity in the rat PASMCs 5 min after hypoxia (×300); B: H2O2 and concentration-dependently increased Red CC-1 fluorescence intensity in rat PASMCs 5 min after hypoxia (×300). Mean±SD. n=4.**P<0.01 vs normoxia.

Figure 3. Treatment with the inhibitors of mitochondrial ETC complexes， MPP, NPA, TTFA and myxothiazol， all prevented hypoxia-induced increase in ROS production.Mean±SD. n=4.**P<0.01 vs hypoxia.

4 常氧及急性缺氧PASMCs线粒体ROS的生成量及生成位点

(1) 与常氧组相比，急性缺氧PASMCs 线粒体ROS(主要是H2O2)的生成量明显增加(P<0.01)。(2) 用线粒体ETC复合物Ⅰ抑制剂MPP (5 μmol/L)、Ⅱ抑制剂NPA (5 mmol/L)和 TTFA(10 μmol/L)及III前泛半醌位点抑制剂myxothiazol (10 μmol/L)都能显著降低缺氧时线粒体ROS的产生(P<0.01)，而III后泛半醌位点抑制剂antimycin A (5.7 μmol/L)和IV抑制剂NaN3(1 mmol/L)对线粒体缺氧ROS的产生无明显影响(P>0.05)，见表1。提示，PASMCs线粒体可以感知缺氧，急性缺氧时线粒体复合物Ⅰ、Ⅱ以及III前泛半醌位点生成ROS增加，而III后泛半醌位点和IV与此无明显关系。

表1 急性缺氧线粒体ETC复合物抑制剂对PASMCs线粒体ROS生成量的影响

讨 论

众所周知，PASMCs细胞浆内游离钙离子浓度(cytoplasmic free Ca2+concentration，[Ca2+]i)升高是HPV发生、发展乃至导致HPV的效应途径。我们既往的研究也证实急性缺氧可引起细胞外Ca2+内流及内质网ryanodine receptor-seneitive钙库的Ca2+释放，二者均可使 [Ca2+]i升高，肺动脉收缩增强[7]，然而PASMCs哪个部位感知缺氧，缺氧信息如何传递引起 [Ca2+]i升高的分子机制还不十分清楚。由于线粒体是细胞内耗氧量最活跃且对缺氧最敏感的细胞器，因此推测线粒体可能就是PASMCs感受缺氧的主要部位。而本研究也证实：线粒体可以直接感知缺氧，在急性缺氧情况下线粒体复合物Ⅰ、Ⅱ以及III前泛半醌位点ROS生成增加，而新近的研究又证实ROS可以引起 [Ca2+]i增加[12]，由此推测HPV的发病机制可能是：急性缺氧触发PASMCs线粒体ETC复合物Ⅰ、Ⅱ以及III前泛半醌位点生成ROS增多，而ROS 本身也可以诱导线粒体产生更多的 ROS，即 ROS 诱导的 ROS 释放(ROS-induced ROS release，RIRR)[13]；而生成增多的ROS(主要H2O2)可作为第二信使自由透过细胞器膜引起 [Ca2+]i的升高，从而导致HPV。

本研究显示，线粒体ETC复合物能够感知缺氧，其产生增多的ROS可能在耦联缺氧信息与肺动脉的机械收缩过程中起关键作用。深入研究PASMCs感知缺氧，缺氧信息的转导机制，有利于阐明HPV的发病机制，并最终为缺氧PH提供新的治疗策略。

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