睾丸注射法制备携带猪PID1基因的转基因兔

祝洪磊，石元，曾勇庆，陈伟，徐正刚，张哲，杨云，张天阳

(山东农业大学动物科技学院，山东 泰安 271018)

睾丸注射法作为精子载体法的一种，是用人工注射的方法将外源基因注入动物睾丸内，使外源基因与睾丸内不同阶段的精子细胞进行转染，最后通过自然交配、人工授精等途径获得转基因动物的过程[1,2]。1994年Sat等[3]率先使用该方法制备转基因小鼠。Farre等[4]用脂质体包裹目的基因后，通过睾丸注射法对猪睾丸进行注射，获得精子阳性率为47%、胚胎阳性率为22%。Giuili等[5]通过睾丸注射使外源基因在小鼠精子中获得高表达。为了进一步研究睾丸注射法在转基因技术中的作用，将带有外源基因和荧光蛋白的真核表达载体，通过睾丸注射法转染到新西兰兔的精子细胞中，探讨外源基因在转基因兔中的表达情况。

随着生活水平的不断提高，人们对猪肉品质的要求也越来越高，肌内脂肪是影响肉质风味的重要指标之一。2010年钱源等[6]研究发现，PID1(磷酸酪氨酸互作结构域1)基因与肌内脂肪的沉积显著相关，并且发现其在高肌内脂肪的莱芜猪中的表达显著高于大白猪。PID1基因是通过抑制性消减杂交技术筛选正常人群和肥胖人群腹膜后脂肪组织时发现的差异表达基因[7]，并且在肥胖人群脂肪组织中的表达显著高于正常人群[8]。Liao等[9]发现PID1基因包含一个磷酸酪氨酸作用位点，与细胞增殖有关。本研究采用睾丸注射法将猪PID1基因转入新西兰兔中，建立转基因兔模型，旨在研究并验证PID1基因对肌内脂肪等肉质性状影响的重要功能和育种价值，为进一步制备肌内脂肪显著提高的转基因猪等育种新材料奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

选择SPF级成年新西兰公兔8只(体重4.2～5.0 kg)、母兔48只(体重4.5～5.0 kg)，其中的公兔6只为实验组、2只为空白对照组。实验兔来源于山东鲁抗医药股份有限公司【SCXK(鲁)2013-0001】；实验兔的饲养及测定在山东泰山种兔场和山东农业大学SPF级屏障动物实验设施进行【SYXK(鲁)2007-0073】，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

重组质粒pIRES2-acGFP-PID1由本实验室构建；各种限制性内切酶、连接酶等购自Fermentas公司(加拿大)；I抗(PID1抗体、actin抗体)购自Abcam公司(英国)，II抗(HRP抗体)购自Sigma公司(美国)；转染试剂为Roche的X-treme GENE HP(瑞士)；其余试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 重组表达载体pIRES2-acGFP-PID1的制备及鉴定

从莱芜猪背最长肌中提取总RNA，并反转录成cDNA。根据GenBank公布的猪PID1基因序列，利用Primer 5软件设计特异性引物，扩增目的基因CDS区序列。上游引物MQPID1-F: GGCTGGAAGATGTGGCAG，下游引物MQPID1-R: TCAGCCATCATCGGATTCT。目的基因测序正确后，在引物5′端分别加入Bgl II和EcoR I酶切位点及保护碱基。对加入酶切位点的目的基因和pIRES2-acGFP质粒分别酶切回收后，用T4连接酶连接。

用连接成功的质粒转化大肠杆菌感受态DH5α菌株，并接种卡那霉素(50 μg/mL)抗性的琼脂平板筛选阳性菌落，LB培养基扩大培养后，用Qiagen的无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒。重组质粒通过酶切鉴定和测序鉴定。

1.2.2 睾丸注射重组质粒及后代的出生

注射液用Roche的X-treme GENE HP转染试剂(μL)与质粒(μg)按照4∶1的比例混合，37℃孵育15 min，添加适当DMEM配成。将公兔麻醉后，对其睾丸组织分3～4点进行注射。对照组注射等量生理盐水。每周注射一次，共注射3次。在相同且适宜的条件下饲养30 d[1,10]后，按照公母比例1:6进行配种。通过自然交配、重复配种的方法保证受胎率。待母兔产下F1代，经过精心饲养，到达性成熟之后，避免近交的前提下，实验组选择健康状况最好、性欲最强的阳性公兔5只和阳性母兔10只进行互交，繁殖F2代个体；F2代空白对照组选择F1代空白对照个体中的2只公兔和5只母兔繁殖F2代。

1.2.3 后代中检测目的基因的表达情况

将存活的刚出生的F1代和F2代个体在IVIS Lumina II成像系统中，观察其体表绿色荧光蛋白的表达情况。

将F1代和F2代个体，打耳号、采耳组织样，用于提取基因组。根据目的基因PID1和重组质粒设计两对特异性引物(表1)，以提取的基因组为模板，用特异性引物进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测子代个体的阳性率。

根据阳性率检测结果，分别提取F1代阳性个体、阴性个体、空白对照个体背最长肌组织的蛋白，进行SDS-PAGE电泳，通过Western blotting检测蛋白表达情况。I抗用封闭液稀释300倍，Ⅱ抗稀释3000倍，最后用TMB显色剂检测。

表1 检测目标基因的特异性引物

1.2.4 后代肌内脂肪含量测定

F1代个体在同样的饲养管理条件下饲养至110 d，平均体重达(2.97±0.15)kg时进行屠宰；F2代个体在同样的饲养管理条件下饲养至90d，平均体重达(2.63±0.24)kg时进行屠宰。根据检测结果，F1代个体选择10只阳性兔、10只阴性兔、8只空白对照兔，F2代个体选择6只阳性兔、6只阴性兔、6只空白对照兔，进行屠宰并采集相关样品。利用索氏抽提法测定肌内脂肪含量，并用SPSS软件对测定数据进行单因素方差分析处理，分析各组肌内脂肪含量的差异。

2 结果

2.1 重组质粒及其鉴定结果

将含有保护碱基和酶切位点的目的基因和pIRES2-acGFP空质粒分别双酶切，用T4连接酶连接构建重组质粒pIRES2-acGFP-PID1(图1)。

注：外源基因连接在pIRES2-acGFP载体启动子CMV后面，PID1基因和载体都用限制性内切酶Bgl II和EcoR I酶切，然后用T4 DNA酶连接。

重组质粒通过克隆转化，用卡那抗性的LB培养基大量扩增，提取重组质粒。一部分用内切酶Bgl II、EcoR I进行酶切鉴定，一部分送上海生工测序部测序(图2)。

注：A：重组质粒pIRES2-acGFP-PID1 用Bgl II和EcoR I酶切后的凝胶电泳图谱，1：pIRES2-acGFP载体，2：重组质粒pIRES2-acGFP-PID1，3：重组质粒Bgl II/EcoR I酶切反应泳道，4：Bgl II酶切反应泳道，5：EcoR I酶切反应泳道，M：DNA分子标准。B：重组质粒中PID1基因的测序鉴定。

2.2 仔代兔荧光、基因组水平和蛋白水平的检测

F1代和F2代仔兔出生后，用IVIS Lumina II成像系统对实验组和空白组的试验仔兔进行活体荧光检测。检测结果如图3中柱状标尺显示的光强度范围是531～1143，两只实验兔光强度范围是-12～1238。图中显示，左侧仔兔为转基因阳性兔，其体表尤其是四肢和尾部有荧光表达，右侧仔兔无荧光表达为空白对照组(见图3)。

注：用IVIS Lumina II成像系统进行荧光检测。左侧是转基因阳性兔，荧光主要集中在四肢和尾部。右侧是空白对照，不发荧光。柱状图表示的荧光强度范围是531～1143。两只仔兔发出的荧光强度范围是-12～1238。

根据重组质粒设计两对特异性引物，提取F1代和F2代个体基因组并作为模板，进行PCR扩增，结果显示实验组中部分个体有目的条带呈阳性，部分个体无条带呈阴性，部分测定结果如图4。F1代实验组共获得170只个体，在饲养过程中死亡12只，170只个体中有阳性个体61只，阴性个体109只，阳性率为35.88%；F2代个体实验组共获得67只个体，在饲养过程中死亡6只，67只个体中有阳性个体23只，阴性个体44只，阳性率为34.33%(表2)。

表2 后代的出生和检测结果

用F1代阳性个体、阴性个体、空白对照个体的背最长肌提取组织蛋白，进行Western blot检测，结果显示转基因阳性个体的PID1蛋白表达增加(图5)。

2.3 仔代兔肌内脂肪含量检测

对F1代和F2代阳性兔、阴性兔、空白对照兔的背最长肌中肌内脂肪含量进行测定，结果显示，F1代和F2代阳性兔的肌内脂肪含量相对于阴性兔和空白对照兔有显著提高(P<0.05)，阴性兔和空白兔差异无显著性(图6)。

注：F1∶F1代，F2∶F2代。①PID1基因PCR扩增产物0.8%凝胶电泳图谱；②CMV基因PCR扩增产物0.8%凝胶电泳图谱。A：空白对照，B：阴性个体，C：阳性个体，M：DNA分子标准。

注：A：SDS-PAGE检测的PID1基因的灰度值，目的片段是54×103。B：SDS-PAGE检测的持家基因的灰度值，参照片段是43×103。1、2：空白对照，3：阴性个体，4、5：阳性个体。

注：同一图片中用不同字母标注的组差异有显著性(P<0.05)，图中显示了标准误。F1代和F2代的变化趋势相同。与阴性个体和对照组相比，阳性个体的肌内脂肪显著升高，但是阴性个体与对照组差异无显著性。

3 讨论

在本研究中，将重组质粒pIRES2-acGFP-PID1和转染试剂共孵育后，加入适量的DMEM配制成注射液，用1 mL注射器直接注射到新西兰兔的睾丸内，通过自然交配获得转基因后代。与传统的睾丸注射法相比，该方法首先将目的基因和转染试剂共孵育，之后再进行睾丸注射，从而使目的基因更容易进入精子细胞内，提高了转染效率，保证了后代阳性率[3,11]。传统的睾丸注射法，是通过手术将睾丸暴露出来，然后进行睾丸注射，之后进行缝合。该研究避免了这一缺点，无需进行手术，直接进行睾丸注射，这是一种改进，降低了感染率，增加了成活率，同时保证了处理公兔繁殖能力的完好。Kim等[12]最早用该方法制备转基因猪，并获得成功。Xiang等[13]用该方法制备转基因小鼠，在F1出生的52只小鼠中，有38.46%的阳性率；F1代阳性个体互交，获得F2代，阳性率为36.36%。Farre等[4]用该法制备转基因猪，获得47%的阳性精子和22%的阳性胚胎。髙华颖等[14]获得85%的阳性仔兔。李福兵等[1]获得66.7%的阳性山羊胚胎。通过与其他研究结果比较发现，睾丸注射法制备转基因动物具有很高的阳性率，但是也存在明显差异。首先阳性率从36.36%到85%大小不等，同时胚胎阳性率也存在较大差异。这种差异可能与外源基因的类型和浓度[1,2]，以及实验动物的种类[1,15]等原因存在一定的关系。

猪肉质性状的评定指标主要包括肌内脂肪、嫩度、失水率、滴水损失、pH值、干物质、肉色等[16]。肌内脂肪作为影响肉质的关键指标之一，其影响因素很多，有营养因素和遗传因素[17]。营养因素主要指日粮水平；遗传因素主要是品种间的差异及遗传基因的影响。我国地方猪种相对于引进品种最重要的特性之一在于肌内脂肪含量丰富，尤其以莱芜猪为代表，肌内脂肪平均含量在10%以上[18]。肌内脂肪的沉积与多种基因的相互作用有关，近年来相关研究发现PID1[6]、A-FABP[19]、H-FABP[20,21]、ADD1[22]等基因可能与肌内脂肪的沉积密切相关。钱源等[6]对莱芜猪、鲁莱黑猪和大白猪的研究发现PID1基因mRNA表达水平与肌内脂肪含量呈显著正相关。

在本研究中，首次通过建立动物模型的方法，研究PID1基因与肌内脂肪的关系。在研究中采用睾丸注射法，将重组质粒pIRES2-acGFP-PID1与脂质体共孵育后，分多点随机注射到新西兰兔的睾丸中，F1代获得35.88%的阳性率，F2代获得34.33%的阳性率。测定结果表明，转基因阳性个体的肌内脂肪含量相对于阴性个体和空白对照个体有显著提高(P<0.05)。本研究不仅进一步证明了睾丸注射法可以用于制备转基因动物，且外源基因可以稳定遗传；而且通过制备转基因动物模型的方式，研究并验证了PID1基因对肌内脂肪等肉质性状影响的重要功能和育种价值，并为进一步制备肌内脂肪显著提高的转基因猪等育种新材料奠定了基础。

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