合成气发酵梭菌C.autoethanogenum的生长特性与CO发酵性能*

徐惠娟 梁翠谊 许敬亮 郭颖 张宇 庄新姝 袁振宏†

(1.中国科学院 广州能源研究所∥可再生能源重点实验室，广东 广州 510640;2.中国科学院大学，北京100049)

自1987年发现第一株可以利用CO 或CO2、H2进行生长并发酵产乙醇的微生物Clostridium ljungdahlii(C.ljungdahlii)之后，一种新的乙醇生产技术——合成气发酵应运而生.该技术以煤、生物质或有机废弃物的气化合成气(主要成分为CO、CO2和H2)为原料，利用特定的微生物将其发酵为乙醇.由于气化过程可以将原料中的所有含碳有机物转化为合成气，因此包括木质素在内的一些难降解物质都可以被利用;而且合成气生物转化具有反应条件温和、专一性强及对合成气中的某些毒害气体具耐受性等优点［1-2］.除气化合成气外，一些富CO 的工业废气(如转炉气、电石炉气、黄磷炉气等)也可以被合成气发酵微生物利用及转化.

C.ljungdahlii 是最早被研究也是研究得最多的合成气乙醇发酵菌株［3-7］，此后，研究者们又陆续发现了其他的一些合成气发酵菌株，包括Clostridium carboxidivorans(C.carboxidivorans)［8-9］、Clostridium autoethanogenum(C.autoethanogenum)［10］、Clostridium ragsdalei(C.ragsdalei)［11-12］及Alkalibaculum bacchi(A.bacchi)［13］等.这些菌株产乙醇的能力各不相同.据报道，C.ljungdahlii 在具细胞循环的连续搅拌罐式反应器(CSTR)中发酵，乙醇的质量浓度高达48 g/L［14］;C.carboxidivorans 在 鼓 泡 柱 式 反 应 器(BCR)中发酵13 d 后，乙醇质量浓度达2.75 g/L［15］;同样在具细胞循环的CSTR 中，A.bacchi 连续发酵30 d 后的乙醇质量浓度达5 g/L 以上［16］.相较之下，C.autoethanogenum 的相关研究较少，而且在仅有的一些报道中，其合成气发酵的乙醇质量浓度都在0.5 g/L 以下［17-18］.合成气发酵菌株基本都是严格厌氧菌，因而通常采用厌氧瓶或血清瓶对它们进行批式发酵研究，下层液相为培养基和菌体，气体底物充满上层空间.但是对于一个气体底物发酵过程而言，这两种容器都存在一定缺陷:由于底物处于固定体积的上层气相中，随着底物的利用，上层气相的压力会逐渐降低，不利于底物的进一步利用，而且这种体积固定的玻璃瓶不便于监测、计量气体的利用情况.有鉴于此，文中拟采用一种新的反应容器来研究合成气发酵过程，克服厌氧瓶或血清瓶的上述缺陷.

C.autoethanogenum 可以利用木糖，且木糖是其生长的优良底物.木质纤维素原料水解液中的一个重要组分即是木糖，但这部分木糖较难被发酵利用.因此，文中拟以C.autoethanogenum 为研究对象，考察其对木质纤维素水解液的利用及CO 发酵性能，探索气体发酵制乙醇的新工艺.

1 材料与方法

1.1 菌株与培养基

所用菌株C.autoethanogenum DSM 10061 购自德国菌种保藏中心.

生长培养基在DSMZ640 培养基［18］和Rajagopalan 培养基［19］的基础上进行了改良，成分(每升)如下:10 mL 无机盐溶液，10 mL 微量元素溶液，10 mL维生素溶液，1.0 g 酵母膏，2.0 g 蛋白胨，0.5 g 半胱氨酸盐酸，5.0 g 吗啉乙磺酸，0.5 mL 0.1%刃天青，5.0 g 木糖，pH=6.其中，无机盐溶液组成如下:NaCl 80 g/L，NH4Cl 100 g/L，KCl 10 g/L，KH2PO410 g/L，MgSO4·7H2O 20 g/L，CaCl2·2H2O 4 g/L;微量元素溶液组成如下:次氮基三乙酸2 g/L，MnCl2·4H2O 1.3 g/L，CoCl2·6H2O 0.2 g/L，ZnSO4·7H2O 0.2 g/L，FeCl3·6H2O 0.4 g/L，CuCl2·2H2O 0.02 g/L，NiCl2·6H2O 0.02 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.02 g/L，Na2WO4·2H2O 0.025 g/L;维生素溶液组成如下:生物素2 mg/L，叶酸2 mg/L，维生素B610 mg/L，维生素B15 mg/L，核黄素5 mg/L，烟酸5 mg/L，泛酸钙5 mg/L，维生素B125 mg/L，对氨基苯甲酸5 mg/L.

发酵培养基不含木糖和蛋白胨，其余组分同生长培养基，pH=6.

配制好的培养基于121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min后，从灭菌锅中取出，立即放入厌氧操作箱中(气氛组成:N285%，H210%，CO25%)，待培养基显示无色后加塞密封.所有接种及取样等操作均在厌氧箱中进行.

1.2 分析方法

发酵液于4 ℃、12000 r/min 下离心10 min，取上清.乙醇与乙酸含量采用Agilent 7890A 型气相色谱仪检测，载气为Ar，采用DB-FFAP 毛细柱(30 m ×0.25 mm×0.25 μm)和FID 检测器，进样口温度为250 ℃，检测器温度为300 ℃.色谱柱先在40 ℃下保持5 min;然后以20 ℃/min 的速度升温至140 ℃，保持3 min;继续以40 ℃/min 的速度升温至250 ℃，再保持3 min.柱流量为1 mL/min，载气流率为30 mL/min，分流比为l∶50.

发酵液中残糖及水解液的成分采用Waters2498高效液相色谱仪(HPLC)检测，Shodex Sugar SH1011柱，以0.005 mol/L 的H2SO4作为流动相，流量为0.5 mL/min，柱温为50 ℃，UV-RI 检测器，检测器温度为50℃.样品需预先离心(12000r/min，10min)并以0.22 μm 滤膜过滤.

气体组分检测采用Agilent 7890A 型气相色谱仪，Agilent 5A 分子筛柱(8ft ×1/8″ ×2 mm，60～80目)和Agilent Hayesep Q 柱(6ft ×1/8″ ×2 mm，80～100 目)，进样器温度为200 ℃，分流比为20 ∶1，柱流量为3 mL/min，TCD 检测器温度为200 ℃.柱子先在60 ℃下保持3 min，再以15 ℃/min 的速率升温到250 ℃.

通过检测600 nm 波长下菌液的光密度(OD)值来测量菌体密度，再根据OD 值与干重的计量关系计算得到细胞干重.前期研究已知每一个OD600对应的细胞干重为247 mg/L.

1.3 碳源对C.autoethanogenum 生长影响的检测

分别以葡萄糖和纤维二糖代替生长培养基中的木糖，保持质量浓度不变(5.0 g/L)，配制成相应的培养基，按10%的接种量接种活化后的C.autoethanogenum 至不同培养基中，于37 ℃培养箱中静置培养4 d，取样检测OD600值及糖含量.在100 mL厌氧瓶中进行反应，培养基为50 mL.

1.4 C.autoethanogenum 生长曲线的测定

反应在500mL 厌氧瓶中进行.按10%的接种量接种活化后的C.autoethanogenum 至生长培养基中，37 ℃下静置培养，定时取样检测OD600值、残糖及产物质量浓度.

1.5 气袋生长-发酵实验

反应在1 L 铝箔气体采样袋(简称气袋，大连德霖气体包装有限公司生产)中进行.气袋预先以N2充放气3 次，再以CO 充放气3 次，然后在压力为0.015 MPa、流量为0.8 L/min 的条件下充气(CO)1 min，关闭旋塞.按10%的接种量接种生长至对数期的C.autoethanogenum 于发酵培养基中，混匀后用注射器抽取样品，从旋塞上的小孔注入气袋中，每个气袋加入55 mL.气袋置于37 ℃培养箱中静置培养，待气袋完全扁下去后取样检测残留气体成分、OD600值及产物质量浓度.随后，按上述条件再次向气袋充气(CO)，重新灌充CO 的气袋继续置于培养箱中培养，待气袋再次完全扁下去后同上进行第二次检测.

CO 乙醇转化率根据下式计算:

1.6 C.autoethanogenum 对蔗渣水解液的利用实验

甘蔗渣粉碎至40～80 目，水洗后于105 ℃下烘干，以1∶20 的质量比与水混合，置于水解反应器中进行水解，水解液冷却后于12 000 r/min 下离心10 min，取上清.以水解液离心后的上清代替生长培养基中的木糖及水，配制成水解液培养基(pH=6).按10%的接种量接种生长至对数期的C.autoethanogenum 于水解液培养基中，在37 ℃下静置培养4 d，取样检测OD600值、残糖及产物质量浓度.反应在100 mL 厌氧瓶中进行，培养基为50 mL.

2 结果与讨论

2.1 碳源对C.autoethanogenum 生长的影响

德国菌种保藏中心推荐的C.autoethanogenum生长培养基中既含木糖，又含纤维二糖，而Abrini等［10］认为C.autoethanogenum 不能利用葡萄糖.文中分别以木糖、葡萄糖和纤维二糖为唯一碳源配制生长培养基，考察C.autoethanogenum 对不同碳源的利用情况，结果如图1 所示.从图中可以看出:以木糖为碳源时C.autoethanogenum 生长最好，菌体质量浓度及糖利用率都远远高于其他两种碳源;C.autoethanogenum 在葡萄糖及纤维二糖培养基中都有少量生长，但是糖利用率都较低(小于10%)，其中对纤维二糖的利用最少.这说明葡萄糖和纤维二糖都不适宜作为C.autoethanogenum 生长培养基的碳源，因此后续研究中均以木糖为生长培养基中的唯一碳源.

图1 C.autoethanogenum 对不同碳源的利用Fig.1 Utilization of different carbon sources by C.autoethanogenum

2.2 C.autoethanogenum 在改良培养基中的生长曲线

图2 为C.autoethanogenum 在改良培养基中的生长曲线.从图中可以看出:第1 天为生长延滞期;从第2 天开始，C.autoethanogenum 进入对数生长期;第4 天后进入稳定期.菌株生长的同时伴随着木糖的消耗及乙酸的生成，而乙醇只在对数生长中期才开始被检测到，且量很少(小于0.25 g/L)，整个生长阶段变化不大，说明乙酸是生长偶联型产物，而乙醇是非生长偶联型产物，这与Klasson 等［20］对C.ljungdahlii 的研究结果一致.因为乙醇和乙酸是由中间代谢物乙酰辅酶A 在不同酶的催化下转化而成的，生成乙酸能产生一分子ATP(三磷酸腺苷)，生成乙醇则不能，因此菌体生长阶段的主要产物是乙酸.此外，在改良培养基中培养4 d 后，C.autoethanogenum 的菌体质量浓度可达311 mg/L，是之前郭颖等［21］研究结果的3 倍多.

图2 C.autoethanogenum 的生长曲线Fig.2 Growth curves of C.autoethanogenum

2.3 气袋生长-发酵实验结果及分析

CO 发酵是一个厌氧气态底物发酵过程，反应式如下所示:

该过程对反应装置的密封性能要求比较高，普通的厌氧瓶较难满足这一点.这是因为，注入瓶中的CO 可能从瓶口泄漏，而且CO 被利用后会使得瓶内上层气相压力降低，存在氧气渗入的可能.文中采用密封性能良好的气体采样袋来研究C.autoethanogenum 的CO 发酵性能，反应前后的气袋变化如图3 所示.由于气袋具有弹性体积，随着CO 逐步被C.autoethanogenum 利用，气袋的体积会逐渐缩小，这既便于观察又使得上层气相的压力相对稳定.虽然发酵过程中会产生一定的CO2，但一方面消耗的CO 摩尔数多于生成的CO2摩尔数，且C.autoethanogenum 可以继续利用CO2(在一定还原力存在下)，另一方面CO2较易溶于水，所以最终气袋里的气体基本能耗尽.

图3 气袋变化图Fig.3 Variation of gas sampling bag

表1 为C.autoethanogenum 的气袋生长-发酵结果.发酵培养基中的酵母膏质量浓度分别为0.8和1.0 g/L，整个生长-发酵过程进行了两次CO 充气操作，每一阶段耗时20 d 左右，最后检测气袋中的余气只有CO2，没有CO.从表1可以看出:在第1阶段，消耗的CO 主要用于菌体生长，菌体质量浓度得到较大增长，产物以乙酸为主，醇酸摩尔比较低，CO 乙醇转化率也较低(小于16%);在第2 阶段，消耗的CO 有一部分仍用于菌体生长，表现为菌体质量浓度继续增加，但是更多的CO 用于合成代谢物乙醇，乙酸质量浓度相比第1 阶段有所降低，乙醇质量浓度则显著提高;在1.0 g/L 酵母膏的发酵培养基中，乙醇质量浓度达到3.464 g/L，CO 乙醇转化率达51.7%.另外，0.8 和1.0 g/L 酵母膏质量浓度下得到的最终菌体质量浓度基本相同，但是后者的乙醇和乙酸质量浓度更高，尤其是乙酸.酵母膏作为培养基中的主要氮源供菌体生长利用，较高的浓度有利于生长，而乙酸是生长过程中的主要代谢物，因此表现为产乙酸较多.但第2 阶段的乙酸质量浓度均出现不同程度的降低，酵母膏质量浓度为0.8 g/L 时更为明显，乙酸质量浓度降至0.252 g/L，使得最终醇酸摩尔比达到15.76，比酵母膏质量浓度为1.0 g/L 时的结果高很多.Klasson 等［20］在研究C.ljungdahlii 时也发现降低酵母膏浓度可以提高产物中的醇酸摩尔比.由乙醇和乙酸的代谢途径得知，乙酸在乙醛氧化还原酶的催化下可转化为乙醛，进一步可继续转化为乙醇，因而可以认为，第2阶段乙醇质量浓度的增加伴随着乙酸质量浓度的降低，说明可能有部分乙酸转化为了乙醇.因此在一定范围内，较高的酵母膏浓度或许是有利的，虽然醇酸比有所降低，但可以获得更高的乙醇浓度，正如表1 的结果所示.关于这一点，笔者将在后续研究中展开更深入的探讨.

表1 C.autoethanogenum 的气袋生长-发酵结果Table 1 Results of growth and fermentation of C.autoethanogenum in gas sampling bag

2.4 C.autoethanogenum 对蔗渣水解液的利用

高温液态水法是针对木质纤维素类生物质的一种绿色预处理方法，它可将木质纤维素中的半纤维素水解为木糖及其低聚糖，而且经高温液态水处理后的纤维素原料更易于后续的酶解.该方法具有不添加化学试剂、发酵毒性副产物少等优点［22-23］，缺点是水解液中得到的木糖浓度不高，如果用于木糖发酵过程需要先进行浓缩.水解过程中产生的副产物主要包括少量的糠醛、5-羟甲基糠醛、葡萄糖醛酸、乙醇酸、甲酸等，通常认为糠醛和5-羟甲基糠醛是发酵的主要抑制物，因此文中主要考察了这两种物质对C.autoethanogenum生长的影响.表2 为C.autoethanogenum 在不同水解液培养基中的生长情况及产物，水解液由不同条件的高温液态水处理蔗渣得到.从表2 可看出:虽然水解液中木糖的质量浓度较低，但仍可用于C.autoethanogenum 的生长;不过，随着5-羟甲基糠醛及糠醛质量浓度的升高，菌体质量浓度降低，说明这两种物质对菌株的生长有一定的抑制作用.经比较，N2环境下180 ℃、4 MPa处理20 min 得到的水解液较适合C.autoethanogenum 的培养，该条件正好也是蔗渣酶解预处理的一个较优条件.

以上述条件处理蔗渣，将得到的水解液与其他营养物质混合制备水解液培养基，接种C.autoethanogenum，在厌氧瓶中培养2 d 后直接将培养液转入已灌注CO 的1 L 气袋进行气袋发酵实验.发酵14 d后气袋体积大幅度减小，检测发现上层气相中的CO已耗尽，取样分析发酵液的OD600及产物质量浓度等，结果如表3 所示.从表3 可以看出，经过两天的培养，水解液培养基中的木糖已经用完，菌体质量浓度达142.1mg/L，产物中含少量乙醇.培养液接入气袋后，CO 成为唯一的碳源，用于生长与代谢，表现为菌体质量浓度继续增加，乙醇质量浓度达到3.13 g/L.由于仍有部分CO 用于菌体的生长，最终的CO 乙醇转化率为46.9%.与表1 的结果相比较，利用蔗渣水解液生长后再进行CO 发酵，得到的乙醇质量浓度及转化率可达到单纯CO 生长-发酵中两次发酵的水平，说明该工艺是可行的，而且具有如下优点:①发酵时间大大缩短，由原来的40 d 左右减少到16 d;②更多的CO 被用于乙醇转化;③将木质纤维素水解液中木糖的利用与CO 发酵有机结合了起来.

表2 C.autoethanogenum 在不同水解液培养基中的生长情况及产物Table 2 Growth and products of C.autoethanogenum in different hydrolysate media

表3 C.autoethanogenum 在蔗渣水解液中的生长情况及CO 发酵结果Table 3 Growth and CO fermentation results of C.autoethanogenum in bagasse hydrolysate medium

3 结论

通过考察C.autoethanogenum 对木质纤维素水解液的利用以及它的生长与CO 发酵性能，得到以下结论:

(1)木糖是C.autoethanogenum 生长的适宜碳源，但不适于乙醇合成，代谢产物以乙酸为主.C.autoethanogenum 在改良培养基中生长良好，菌体质量浓度较之前的研究结果提高两倍以上.

(2)由于具有弹性体积及良好的气密性能，气袋非常适合用于气体发酵的研究.C.autoethanogenum 能够以100% CO 为唯一碳源进行生长并合成乙醇，虽然生长速度比以木糖为碳源时慢，但是产物中的乙醇质量浓度大大提高，在1 L 气袋中经过两次CO 发酵，乙醇质量浓度达3.464 g/L，CO 乙醇转化率达51.7%.

(3)N2环境、180 ℃、4 MPa 下，20 min 高温液态水处理蔗渣得到的水解液可用于C.autoethanogenum 的培养，再偶联CO 发酵，该工艺的发酵结果可达到单纯CO 生长-发酵时两次发酵的水平，而且发酵时间大大缩短，CO 转化为乙醇的效率提高.

［1］Vega J L，Klasson K T，Kimmel D E，et al.Sulfur gas tolerance and toxicity of CO utilizing and methanogenic bacteria［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，1990，24/25(1):329-340.

［2］Ahmed A，Cateni B G，Huhnke R L，et al.Effects of biomass generated producer gas constituents on cell growth，product distribution and hydrogenase activity of Clostridium carboxidivorans P7T［J］.Biomass and Bioenergy，2006，30(7):665-672.

［3］Tanner R S，Miller L M，Yang D.Clostridium ljungdahlii sp nov，an acetogenic species in clostridial rRNA homology group Ⅰ［J］.International Journal of Systematic Bacteriology，1993，43(2):232-236.

［4］Barik S，Prieto S，Harrison S B，et al.Biological production of alcohols from coal through indirect liquefaction［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，1988，18(1):363-378.

［5］Phillips J，Clausen E，Gaddy J.Synthesis gas as substrate for the biological production of fuels and chemicals［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，1994，45/46(1):145-157.

［6］Klasson K T，Elmore B B，Vega J L，et al.Biological production of liquid and gaseous fuels from synthesis gas［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，1990，24/25(1):857-873.

［7］Younesi H，Najafpour G，Mohamed A R.Ethanol and acetate production from synthesis gas via fermentation processes using anaerobic bacterium，Clostridium ljungdahlii［J］.Biochemical Engineering Journal，2005，27(2):110-119.

［8］Liou J S-C，Balkwill D L，Drake G R，et al.Clostridium carboxidivorans sp nov，a solvent-producing clostridium isolated from an agricultural settling lagoon，and reclassification of the acetogen Clostridium scatologenes strain SL1 as Clostridium drakei sp nov［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2005，55(5):2085-2091.

［9］Ahmed A，Lewis R S，Fermentation of biomass-generated synthesis gas:effects of nitric oxide ［J］.Biotechnology and Bioengineering，2007，97(5):1080-1086.

［10］Abrini J，Naveau H，Nyns E.Clostridium autoethanogenum sp nov，an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide［J］.Archives of Microbiology，1994，161(4):345-351.

［11］Saxena J，Tanner R S.Effect of trace metals on ethanol production from synthesis gas by the ethanologenic acetogen，Clostridium ragsdalei ［J］.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2011，38(4):513-521.

［12］Kundiyana D K，Wilkins M R，Maddipati P，et al.Effect of temperature，pH and buffer presence on ethanol production from synthesis gas by“Clostridium ragsdalei”［J］.Bioresource Technology，2011，102(10):5794-5799.

［13］Allen T D，Caldwell M E，Lawson P A，et al.Alkalibaculum bacchi gen nov，sp nov，a novel CO oxidizing，ethanol producing acetogen isolated from livestock-impacted soil［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2010，60(10):2483-2489.

［14］Klasson K T，Ackerson M D，Clausen E C，et al.Biological conversion of coal and coal-derived synthesis gas［J］.Fuel，1993，72(12):1673-1678.

［15］Datar R P，Shenkman R M，Cateni B G，et al.Fermentation of biomass-generated producer gas to ethanol ［J］.Biotechnology and Bioengineering，2004，86(5):587-594.

［16］Liu K，Atiyeh H K，Stevenson B S，et al.Continuous syngas fermentation for the production of ethanol，n-propanol and n-butanol［J］.Bioresource Technology，2014，151:69-77.

［17］Guo Y，Xu J，Zhang Y，et al.Medium optimization for ethanol production with Clostridium autoethanogenum with carbon monoxide as sole carbon source［J］.Bioresource Technology，2010，101(22):8784-8789.

［18］Cotter J L，Chinn M S，Grunden A M.Influence of process parameters on growth of Clostridium ljungdahlii and Clostridium autoethanogenum on synthesis gas ［J］.Enzyme and Microbial Technology，2009，44(5):281-288.

［19］Rajagopalan S，Datar R P，Lewis R S.Formation of ethanol from carbon monoxide via a new microbial catalyst［J］.Biomass and Bioenergy，2002，23(6):487-493.

［20］Klasson K T，Ackerson M D，Clausen E C，et al.Bioconversion of synthesis gas into liquid or gaseous fuels［J］.Enzyme Microbial Technology，1992，14(8):602-608.

［21］郭颖，许敬亮，徐惠娟，等.合成气和培养基组分对C autoethanogenum 发酵产乙醇的影响研究［J］.太阳能学报，2011，32(9):1370-1374.Guo Ying，Xu Jingliang，Xu Huijuan，et al.Study on composition effects of syngas and medium on ethanol production with Clostridium autoethanogenum［J］.Acta Energiae Solaris Sinica，2011，32(9):1370-1374.

［22］余强，庄新姝，袁振宏，等.高温液态水中甜高粱渣半纤维素水解及其机理［J］.化工学报，2012，63(2):599-605.Yu Qiang，Zhuang Xinshu，Yuan Zhenhong，et al.Hydrolysis of sweet sorghum bagasse hemicellulose with liquid hot water and its mechanism［J］.CIESC Journal，2012，63(2):599-605.

［23］Yu Y，Lou X，Wu H.Some recent advances in hydrolysis of biomass in hot-compressed water and its comparisons with other hydrolysis methods ［J］.Energy ＆ Fuels，2008，22(1):46-60.