基于亲和素修饰磁珠的电化学检测特殊序列DNA的研究

张玉忠，董 笑，陆晓翠

(安徽师范大学 化学与材料科学学院，安徽 芜湖 241000)

基于亲和素修饰磁珠的电化学检测特殊序列DNA的研究

张玉忠，董 笑，陆晓翠

(安徽师范大学 化学与材料科学学院，安徽 芜湖 241000)

报道了一种基于亲和素修饰磁珠表面的电化学检测特殊序列靶DNA的新策略.其方法如下：首先磁珠表面用亲和素功能化，然后利用生物素-亲和素的特殊识别作用，将生物素-探针DNA固定在磁珠表面，通过分子杂交，将另一条含有二茂铁标记互补碱基序列的靶DNA，进行识别，结合形成双链.利用示差脉冲伏安法检测二茂铁产生的电化学信号进行定量.在最佳条件下，二茂铁的峰电流强度与靶DNA浓度的对数在10-9-10-7M范围内呈线性关系.其线性回归方程：I(μA)= 5.598+0.549lgCDNA，相关系数为0.9962，检测限是3.5×10-10M(S/N=3).此外，该传感器具有良好的选择性，它能识别单碱基错配序列的靶DNA.

磁珠；二茂铁；DNA；差示脉冲伏安法

人类的某些疾病及遗传缺陷与基因突变有关，因此特定序列DNA的检测在基因疾病诊断、治疗方面显得越来越重要.电化学传感器具有简单、快速、灵敏和易于微型化的特点而受到十分关注.近年来，纳米科学及技术的发展为电化学DNA生物传感器的发展提供了更好的平台.基于纳米材料的各种高灵敏、选择性的电化学传感器已有报道[1-3].

磁性纳米粒子是一种特殊的纳米材料，具有高比表面积，良好的生物相容性，且在磁场作用下很容易进行磁性分离或富集，目前已经应用于药物传输[4]、DNA杂交检测[5，6]等领域.例如：利用磁性纳米粒子的高表面积，可提供大量探针DNA的固定及利用磁铁将探针DNA-磁性纳米粒子与反应溶液分离.通过控制磁场的变化可以将非特异性固定在磁性纳米粒子表面的探针DNA除去，提高了检测的灵敏度.因此这种方法简单、无须在电极表面进行复杂的修饰，方法的重现性好.基于磁珠的优异性能，本文设计了一种简单的乙肝病毒DNA序列的检测方法.即将一端修饰了生物素的单链DNA作为探针，通过生物素-亲和素之间的特异性结合，将探针DNA连接到将亲和素修饰磁珠表面，以二茂铁作为电活性指示剂，并将其标记在靶DNA的一端，利用杂交反应使二茂铁标记的靶DNA与探针DNA形成双链，差示脉冲伏安技术检测杂交后形成双链的二茂铁信号，对靶DNA进行定量，该方法简单、具有良好的选择性(传感器的制备原理如图1所示).

图1 DNA杂化及检测过程示意图Fig 1 Schematic representation of the procedure for DNA hybridization detection

1 实验部分

1.1仪器与试剂

CHI 660C电化学工作站(上海辰华仪器公司)；三电极系统：玻碳电极(Φ=3mm)为工作电极, Ag/AgCl电极(3.0 M KCl)为参比电极, 铂电极为对电极；pHS-2C精密酸度计(上海伟业仪器厂)，磁铁.

三羟甲基氨基甲烷(Tris)购自Alfa公司；亲和素修饰的磁珠来源于Invitrogen Dynal公司；各种核苷酸片段购买于上海生工生物工程技术服务有限公司，其序列如下：

探针DNA:5′-Biotin-AAT-GTG-CTC-CCC-CAA-CTC-CTC-3′

完全互补DNA:5′-FC-GAG-GAG-TTG-GGG-GAG-CAC-ATT-3′

完全不互补DNA:5′-FC-AAA-AGG-TGT-AAG-CGT-TTG-CCG-3′

单碱基错配DNA:5′-FC-GAG-GAG-TTG-AGG-GAG-CAC-ATT-3′

DNA 储备液由10 mM Tris-HCl(pH 7.4，含1 mM EDTA)配制；电化学测试和清洗溶液为10 mM Tris-HCl(pH 7.4，含0.25 M NaCl )；DNA杂交溶液为20 mM Tris-HCl(pH 7.4，含0.5 M NaCl )组成.实验中所需试剂均为分析纯，水为去离子二次石英蒸馏水.

1.2探针DNA-磁珠复合物的制备

按照磁珠说明书将生物素修饰的探针DNA连接到亲和素修饰磁珠表面上，具体操作过程如下：将50 μL Tris-HCl溶液，5 μL磁珠(10 mg/mL)和30 μL的探针DNA加入到小试管中混合，并在37 ℃的水浴中孵化30分钟.利用磁铁对磁珠进行富集60秒，弃去上清液，接着在磁场存在下对探针DNA磁珠复合物，利用清洗液洗涤2-3次，最后将得到的探针DNA-磁珠复合物重新分散在50 μL的杂交溶液中，待用.

图2 不同溶液的循环伏安曲线：(a)Tris-HCl溶液；(b)探针DNA-磁珠复合物与目标DNA杂交后的溶液Fig.2 Cyclic voltammetry curves of the different solutions: (a) Tris-HCl buffers; (b) The solution of the probe DNA-magnetic beads composites hybridize with target DNA

1.3DNA杂交及电化学检测

将各种不同浓度的二茂铁标记的靶DNA加入到探针DNA-磁珠复合物的溶液中，于37 ℃水浴中杂交40分钟，之后在磁铁的作用下，杂交产物吸附在试管的一侧，弃去上清液，并对反应产物进行富集和清洗，以除去没有杂化的靶DNA.最后将其分散在电化学测试液中，待测.

将玻碳电极参照文献进行活化处理[7]，然后置于三电极系统中.采用差示脉冲伏安法对杂交液进行测试，测试前通氮除氧10分钟，并在测试过程中保持氮气氛.通过检测二茂铁的电化学性号，判断DNA杂交的效果.其技术参数如下：电位范围：-0.2～+0.6 V.脉冲振幅：50 mV.

2 结果与讨论

2.1实验可行性的验证

为了判断这种设计策略的可行性，对空白溶液和含有杂交反应产物的溶液分别进行了电化学表征，结果如图1所示.从图中可以看出，在空白Tris-HCl溶液中的没有伏安信号(曲线a)；而含有杂交产物溶液(曲线b)则在+0.2 V附近出现了一对氧化还原峰，这对峰来源于二茂铁的氧化还原过程.根据以上实验现象，判断这种方法设计在实验上是可行的.

2.2实验条件的优化

实验中，对溶液pH和杂交时间实验条件进行了优化，其结果如图3所示中.从图3A可以看出随着溶液pH从6.4增加到7.4，二茂铁的电化学信号也逐渐增强，当溶液pH为7.4时，其信号强度达到最大，此时pH值继续升高，其信号强度则减小，表明该实验中溶液的最佳pH值为7.4.图3B显示杂交时间对信号强度的影响，随着杂交时间的增加，其信号强度也增加，在40分钟时，信号强度达到最大，所以最佳杂交时间为40分钟.

图3 实验条件对二茂铁电化学信号的影响：(A)溶液pH值；(B)杂交时间.互补DNA浓度为3×10-8MFig.3 Effect of the various experimental conditions on the electrochemical signal of ferrocene:(A) the solution pH; (B) hybridization time. The concentration of target DNA was 3.0×10-8 M

2.3选择性实验

图4 探针DNA(a)与各种不同核苷酸序列杂化检测结果.(b)完全不互补序列；(c)单碱基错配序列；(d)完全互补序列.浓度为1.0×10-8M Fig.4 The result of the probe DNA based on magnetic beads (a) hybridized with different DNA sequences: (b) non-complementary sequence; (c) single-base mismatch sequence; (d) complementary sequence; concentration :3.0×10-8M

实验中，考察了完全不互补DNA、单碱基错配DNA以及完全互补DNA序列进行实验，从而判断实验方法的选择性.其结果如图4所示.当与完全不互补的DNA序列杂交之后(b)，由于不能与探针DNA形成双链固定到探针DNA-磁珠复合物的表面，所以经清洗后的复合物不带有任何电活性物质，即检测不到任何电化学信号；当与单碱基错配DNA序列(c)杂交之后，呈现较弱的电化学的信号，其值为0.2295 μA，与完全互补序列(d)杂交时，其信号最大，其值为1.095 μA.单碱基错配序列产生的信号约占互补序列的20.96%，数据结果表明这种方法对特定序列DNA的检测方法具有很好的选择性.

图5 A.探针DNA与不同浓度的目标DNA杂交后的二茂铁的差示脉冲伏安曲线(a) 1.0×10-9M; (b) 3.0×10-9M; (c) 1.0×10-8 M; (d) 3.0×10-8 M; (e) 1.0×10-7 M; (f) 3.0×10-7 M.(B)二茂铁的峰电流与互补DNA浓度对数的关系曲线Fig.5 (A) DPV curves of the ferrocene of the probe DNA based on magnetic beads hybridize with various concentrations of complementary DNA: (a) 1.0×10-9M; (b) 3.0×10-9M; (c) 1.0×10-8M; (d) 3.0×10-8M; (e) 1.0×10-7M; (f) 3.0×10-7M.(B) Logarithmic plot of peak current of the ferrocene vs. target DNA concentration

3.4分析性能

用探针DNA分别与不同浓度的靶DNA杂交，测定其电化学信号，结果表明：随着靶DNA浓度的增加，其电化学信号强度随着增加，且浓度在1.0×10-9M～3.0×10-7M范围内，其电化学信号强度与靶DNA浓度的对数成良好的线性关系，其线性方程为I(μA)=5.598+0.549lgCDNA，线性相关系数为0.9962，检测限是3.5×10-10M(S/N=3).

4 结论

本文利用磁珠及生物素和亲和素之间的特异性结合的特点，设计了一种新的检测DNA的途径，这种方法简单，易操作，选择性好.因此该方法有望用于临床分析.

[1] 李蜀萍，黄蕾，张玉忠.基于金纳米粒子/石墨烯修饰电极的电化学DNA阻抗传感器的制备[J].安徽师范大学学报：自然科学版,2013,36(4):347-351.

[2] HUA Y W, HUA S C, LI F H, JIANG Y Y, BAI X X, LI D, NIU Li. Green-synthesized gold nanoparticles decorated graphene sheets for label-free electrochemical impedance DNA hybridization biosensing[J]. Biosen Bioelectron, 2011,26:4355-4361.

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StudyonElectrochemicalDetectionofSpecificSequenceDNABasedontheStreptavidinFunctionalizedMagneticBeads

ZHANG Yu-zhong, DONG Xiao，LU Xiao-cui

(College of Chemistry and Materials Science, Anhui Normal University, Wuhu 241000, China)

The paper reported a new strategy for the electrochemical detection of specific sequence DNA based on streptavidin functionalized magnetic beads. First, the biotin-ssDNA as probe and immobilized on the surface of the streptavidin functionalized magnetic beads through the specific binding of the biotin-avidin. The target DNA labeled with ferrocene was recognized by probe DNA and formed the dsDNA through molecule hybridization reaction. Different pulse voltmmetry was employed to measure the electrochemical signal of the ferrocene. The peak current intensities of ferrocene were linear with the logarithm of the target concentration from 10-9to 10-7M with a detection of limit of 3.5×10-10M(S/N=3), The linear regression equation was I=5.598+0.549log c, with a correlation coefficient of 0.9962. Moreover, the biosensor shows good selectivity, even though it can distinguish single base mismatch target DNA sequence.

magnetic bead ferrocene; DNA； different pulse voltmmetry;

2013-11-08

国家自然科学基金(20675002).

张玉忠(1965-)男，安徽歙县人，教授,博士.

张玉忠，董笑，陆晓翠.基于亲和素修饰磁珠的电化学检测特殊序列DNA的研究[J].安徽师范大学学报：自然科学版，2014，37(1)：16-19.

O657.1

A

1001-2443(2014)01-0016-04