养真接骨胶囊质量标准研究

焦宁 杨劼 马华民 韩丽

·药物研究·

养真接骨胶囊质量标准研究

焦宁 杨劼 马华民 韩丽

中药质量标准；药品检验

养真接骨胶囊是我院研制的纯中药制剂，由黄瓜子、自然铜、制川乌、乳香、没药、川芎、续断、土鳖虫、红花、骨碎补等组成，具有补肾壮骨、止痛、活血化瘀、续筋接骨的功效，能加速成骨、促进骨折愈合。过去中药制剂只要求定性检测而不要求定量检测，为了更好的控制药品质量及满足最新制剂规范的要求，我们进行了养真接骨胶囊的质量标准研究。本研究以中医药理论为指导，结合现代分析技术，以骨碎补中的有效成分柚皮苷[1]的含量为指标，并辅以其他药味薄层鉴别研究，来评价该药的质量；本品中含有中药制川乌，其成分乌头碱是毒性成分，因此对其进行了限量检查。

1 材料与仪器

1.1 材料 养真接骨胶囊(由河北医科大学第三医院制剂室提供)；对照品、对照药材均购自中国药品生物制品检定所。试剂：甲醇(色谱纯，美国天地)、乙腈(色谱纯，美国天地)、水(超纯水,18.2MΩ.cm )。

1.2 主要仪器 LC-15C高效液相色谱仪(岛津)；SIL-10AF自动进样器；CTO-15C柱温箱；SPD-15C紫外检测器；Shimadzu工作站；UPH-I-20L超纯水制造系统(成都超纯科技有限公司)。电子分析天平(AG135)。硅胶G(青岛海洋化工厂)。

2 质量控制方法

2.1 薄层色谱条件

2.1.1 续断的薄层色谱鉴别：取本品内容物3 g，加甲醇50 ml，超声处理30 min，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取续断对照药材3 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述供试品溶液10 μl、对照药材溶液5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上。以正丁醇-乙酸-水(4∶1∶5)上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点，重现性良好，阴性无干扰。

2.1.2 乳香的薄层色谱鉴别：取本品内容物3 g，加乙醚50 ml，超声处理30 min，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取乳香对照药材0.2 g，加乙酸乙酯1 ml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%的香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点，重现性良好，阴性无干扰。

2.1.3 土鳖虫的薄层色谱鉴别：取土鳖虫对照药材2 g，加甲醇30 ml，超声处理30 min，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取“2.1.1”项下供试品溶液10 μl、上述对照药材溶液10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上。以甲苯-三氯甲烷-丙酮(5∶5∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点，重现性良好，阴性无干扰。

2.1.4 川芎的薄层色谱鉴别：取川芎对药材0.5 g，加乙醚30 ml，超声处理15 min，滤过，滤液加乙酸乙酯1 ml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取“2.1.2”项下供试品溶液10 μl、上述对照药材溶液5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点，重现性良好，阴性无干扰。

2.2 制川乌中乌头碱的限量检查 取本品内容物3 g，加浓氨试液4 ml，拌匀，放置2 h，加乙醚40 ml，振摇，放置24 h，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇溶解并转移至2 ml容量瓶中,加无水乙醇定容至刻度，作为供试品溶液。另取乌头碱对照品，加无水乙醇制成每1 ml含1 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液5 μl、对照品溶液4 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正已烷-乙酸乙酯-乙醇-浓氨(6.5∶3.5∶1∶0.1)为展开剂，置氨蒸气饱和的层析缸内展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾溶液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，出现的斑点应小于对照品的斑点。

2.3 含量测定方法

2.3.1 供试品溶液的制备：取本品10粒，除去胶囊壳，精密称定，置索氏提取器中，加100 ml乙醚提取2 h，弃去乙醚提取液，残渣干燥后加200 ml甲醇提取4 h，回收甲醇，剩余适量转移至25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.3.2 HPLC法测定养真接骨胶囊中柚皮苷含量的方法学考察

2.3.2.1 色谱条件：流动相：wondasil ODS色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm；日本岛津)；柱温35℃；乙腈：水(30:70)；检测波长212 nm；流速1 ml/min。

2.3.2.2 对照品溶液的制备：精密称取柚皮苷对照品15.00 mg,置50 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得，浓度为300 μg/ml。

2.3.2.3 专属性考察：按处方比例称取除骨碎补外的其它药材，照制备工艺制得缺骨碎补的阴性样品，按供试品溶液制备方法进行制备，得到缺骨碎补的阴性样品溶液。分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液10 μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行分析，得相应的色谱图，比较各色谱图。结果阴性样品溶液色谱图中未检出柚皮苷吸收峰，表明在本实验条件下柚皮苷专属性良好，峰形良好，无杂质峰干扰，结果见图1。

Fig.1 Specific test of Naringin

2.3.2.4 线性关系考察：分别取对照品溶液1，2，3，4，5，6 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀配制成浓度分别为30、60、90、120、150、180 μg/ml的溶液，分别精密吸取10 μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行分析，测定其峰面积，以对照品进样量(μg)(x)为横坐标，峰面积积分值(y)为纵坐标，求得回归方程，绘制标准曲线。柚皮苷回归方程为：y=2334.8x+9171(n=6，r=0.9999)，线性范围为300～1 800 μg，最低定量限为标准曲线最低点300 μg。

2.3.2.5 精密度试验：精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行分析，测定6次，记录峰面积，计算相对标准偏差。结果显示柚皮苷对照品峰面积平均值为2823117，RSD为0.30%，供试品峰面积平均值为2009259，RSD为0.33%，表明仪器精密度良好。

2.3.2.6 稳定性试验：精密吸取对照品溶液10 μl和供试品溶液各10 μl，于0、2、4、8、12、24 h注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行分析，记录峰面积，计算相对标准偏差。结果显示，柚皮苷对照品在24 h内峰面积稳定，RSD为0.27%，供试品在24 h内峰面积稳定，RSD为0.41%。

2.3.2.7 重复性试验：取同一批样品，设高、中、低三个浓度(1.5∶1∶0.5)，每个浓度平行3份，按“2.2.1”项下方法制备，测定峰面积，计算平均含量及相对标准偏差。结果表明，高、中、低三个不同浓度的RSD为0.95%，表明方法重复性良好。

2.3.2.8 回收率试验：采用加样回收率试验，取同一批样品设高、中、低三个浓度，每个浓度平行3份，各浓度水平加入对照品的量与所取供试品含量之比分别为1∶1.5、1∶1、1∶0.5。按“2.2.1”项下方法制备，测定峰面积，计算回收率及相对标准偏差。由加样回收试验结果可知，平均回收率为98.06%，RSD为4.08%，表明该方法准确可靠。

3 讨论

本制剂为十味药材的复方制剂，我们逐一进行了薄层鉴别研究，建立了七味药材的鉴别方法，鉴别方法专属性强，处理过程简单，能有效控制制剂的质量。

骨碎补主要含有黄酮类化合物[2]，柚皮苷为其主要有效成分[1]。柚皮苷的含量测定多采用甲醇-醋酸-水体系，本研究尝试甲醇-醋酸-水(40∶3∶60)[3]、甲醇-水-冰醋酸(35∶65∶4)[4]、甲醇-水-冰醋酸(35∶65∶0.3)[5]等比例，最终确定应用2010版药典记载方法，甲醇-醋酸-水(34∶4∶65)作为流动相。本方法分析时间短、准确、灵敏、重复性好。

1 王雪妮,张德芹.骨碎补外用功能主治研究进展.中国医药导报,2012,9:13-14,17.

2 尚振苹,赵庆春,谭菁菁,等.骨碎补的化学成分.实用药物与临床,2010 13:262-263,277.

3 伍奕,蒋晓煌,蒋孟良,等.骨碎补中柚皮苷含量测定方法的优化研究.湖南中医药大学学报,2010,30:48-50.

4 张静赟,刘战宏,宋愿智.高效液相色谱法测定接骨续筋片中柚皮苷的含量.医药导报.2009,28:366-367.

5 秦雪梅,杨国红,漆小梅.高效液相色谱法测定接骨增效胶囊中柚皮苷含量.中国医院药学杂志,2002,22:397-399.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.04.057

050051 石家庄市，河北医科大学第三医院药剂科

R 927.1

A

1002-7386(2014)04-0604-02

2013-08-21)