TGF－β对AngⅡ调节人成纤维细胞Toll样受体2表达中的影响

胡艺琼 方玲 郭昌云 刘先哲 余旻 鲍容辉 李冠兰 滕林 余静

国内外实验已证明 AngⅡ与TGF－β关系密切，AngⅡ能促进多种细胞中TGF－β的表达。AngⅡ修饰动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)中炎性反应的许多步骤而影响AS的发展［1］。大部分学者认为TGF－β在AS中起保护性作用，即抑制AS中炎症的发生，延缓AS的发展，活化的 TLR2促进内膜粥样斑块的形成［2－4］。本课题前期实验已经证实了AngⅡ能够上调体外培养的HT－1080中TLR2表达。本次试验首次采用TGF－β和TGF－β的抑制剂Decorin刺激体外培养的人成纤维细胞，观察TGF－β在AngⅡ促TLR2表达中的影响，从而在分子水平上探讨AS的发病机制，并为临床治疗AS提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂 HT－1080细胞(人成纤维细胞)(武汉典型培养物保藏中心细胞库)，Dulbecco改良Eagle培养基DMEM(GIBCO)，小牛血清(杭州四季青生物技术有限公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，血管紧张素II(Sigma公司)，TGF－β(PeproTech Asia公司)，TGF－β抑制剂Decorin(R＆D公司)，Trizol试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司;实时定量PCR各种试剂均购自 Promega;DNA Maker购自 TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 HT－1080的传代培养及分组:收到定购的细胞后先将培养瓶内的培养液在超净工作台内用吸管全部吸出，置于另一无菌容器，再向培养瓶中加入1 ml胰蛋白酶，37℃消化直到细胞脱落，换新的培养瓶，加入吸出的培养液，在37℃，5%CO2培养箱培养，当细胞生长到90% 以上单层融合状态时，即可加入胰蛋白酶进行消化，按1∶2进行传代培养。细胞分为:①正常对照组:取2瓶处于对数生长期的HT－1080细胞进行1∶2传代(传代后调节细胞浓度为104/ml，每瓶接种细胞悬液5 ml)，正常培养至24 h。②阴性对照组:取2瓶处于对数生长期的HT－1080细胞进行1∶2传代(传代后调节细胞浓度为 104/ml，每瓶接种细胞悬液4.4 ml)，待细胞贴壁后(约传代后4 h)每瓶细胞分别加入高压灭菌的PBS溶液100 μl，培养4 h后每瓶细胞内加入高压灭菌的三蒸水500 μl，继续培养至24 h。③AngⅡ刺激组:取2瓶处于对数生长期的HT－1080细胞进行1∶2传代(传代后调节细胞浓度为104/ml，每瓶接种细胞悬液4.4 ml，小牛血清浓度为10%)，将其中4瓶细胞加入高压灭菌的PBS溶液100 μl，恒温培养0.5 h 后 4 瓶细胞分别加入 10－3、10－4、10－5、10－6mol/L的 AngⅡ溶液 500 μl(AngⅡ加入培养瓶后分别浓度变为 10－4、10－5、10－6、10－7mol/L)，继续培养至24 h。④TGF－β刺激组 取2瓶处于对数生长期的HT－1080细胞进行1∶3传代(传代后调节细胞浓度为104/ml，每瓶接种细胞悬液4 ml，小牛血清浓度为10%)，将其中四瓶细胞分别加入 TGF－β100、10、1、0.1 μg/L 500 μl，恒温培养 0.5 h 后四瓶细胞加入高压灭菌的三蒸水500 μl(TGF－β加入培养瓶后分别浓度变为 10、1、0.1、0.01 μg/L)继续培养至 24 h。⑤Decorin+AngⅡ刺激组取2瓶处于对数生长期的HT－1080细胞进行1∶3传代(传代后调节细胞浓度为104/ml，每瓶接种细胞悬液4.4 ml，小牛血清浓度为10%)，将其中四瓶细胞分别加入 80、40、20、10 μg/ml的Decorin溶液100 μl，培养4 h后每瓶细胞内加入10－5mol/L 的 AngⅡ溶液 500 μl(AngⅡ浓度变为10－6mol/L)，继续培养至24 h。

1.2.2 RT－PCR各组细胞按照上述分组方法处理后收集并提取总RNA采用Trizol试剂一步法抽提，并对抽提的RNA用1.2%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，以确定RNA的纯度及完整性。RT－PCR采用两步法:各组 RNA 定量2 μg、5 × 逆转录缓冲液4 μl、100 mmol/L二硫代苏糖醇(DTT)1 μl、100 μmol/L Oligo(dT15)1 μl、10 mmol/L dNTP 2 μl加 DEPC 处理水至总体积为18 μl，稍离心65℃温育5 min后置于冰上，加入逆转录酶(MMLV)逆转录酶(100 U/μl)2 μl，37℃ 逆转录60 min，94℃ 5 min灭活逆转录酶。PCR反应体系:0.5 mmol/L dNTP 1 μl、10 × PCR 缓冲液 2 μl、25 mmol/L MgCl22 μl、2.5 U/μl Taq DNA 聚合酶0.4 μl、灭 菌 三 蒸 水 9.6 μl、反 转 录 产 物 2 μl、4 μmol/L 上游引物 1 μl、4 μmol/L 下游引物 1 μl、Taqma探针 1 μl。PCR 反应条件为:预变性 94℃3 min、变性95℃10 min 1个循环，退火95℃ 15 s、延伸56℃ 1 min 40个循环。TLR2上游引物序列:5’－CTACTGGGT GGAGAACCTTATGGT－3’，TLR2 下游引 物 序 列:5’－CCGCTTATGAAGACACAACTTGA－3’，cDNA长度 77 bp，TLR2 探针序列:5’－CAGGAGCTGGAGAACTTCAATCCCCC－3’;GAPDH 上游引物序列:5’－GAAGGTGAAGGTCGGAGTC－3’，GAPDH 下游引物序列:5’－GAAGATGGTGATGGGATTTC－3’，cDNA 长度 225 bp，GAPDH 探针序列:5’－CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC－3’。PCR产物在2.5% 琼脂糖凝胶电泳(90 V，20 min)，Gene Genius凝胶分析系统成像(反应体系由试剂公司提供，上两届师姐完善后留下的)。MMLV一般温度较低，最适温度是37℃;amv是42～55℃。

1.3 统计学分析 应用SPSS 10.0统计软件，计量资料以表示，先进行数据的正态分布检验，方差齐性检验，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阴性组TLR2基因的表达量与空白对照组基本相等(P＞0.05)。见图1、2。

图1 空白组和阴性组TLR2基因表达的对比

图2 TLR2 PCR产物电泳图

2.2 AngⅡ作用于体外培养的HT－1080后发现:该组细胞内TLR2的基因表达量高于空白对照组(P＜0.05)。见表1、图3。

表1 AngⅡ对TLR2基因表达的影响±s

表1 AngⅡ对TLR2基因表达的影响±s

注:空白组比较，*P＜0.01

空白组 阴性对照组 AngⅡ0.1 μmol/L AngⅡ1 μmol/L AngⅡ10 μmol/L AngⅡ100 μmol/L 1±0.282 1.123±0.130* 3.437±0.373* 4.882±0.388* 5.104±0.25* 5.629±0.288*

图3 AngⅡ组TLR2PCR扩增产物

2.3 TGF－β作用于体外培养的HT－1080后发现:该组细胞内低浓度(0.1、0.01 μg/L)TGF－β 促进 TLR2 的基因表达，且表达量高于空白对照组，高浓度(1.0、10 μg/L)TGF－β抑制 TLR2的基因表达，且表达量低于空白对照组(P＜0.05)。见表2、图4。

表2 TGF－β对TLR2基因表达的影响±s

表2 TGF－β对TLR2基因表达的影响±s

注:与空白组比较，*P ＜0.05，#P ＜0.01

空白组 阴性对照组 TGF－β0.01 μg/L TGF－β0.1 μg/L TGF－β1.0 μg/L TGF－β10.0 μg/L 1±0.282 1.123±0.130 4.564±0.333# 2.393±0.15# 0.856±0.065* 0.584±0.056#

图4 TGF－β组及Decorin+AngⅡ组TLR2 PCR扩增产物

2.4 TGF－β抑制剂Decorin和AngⅡ联合作用于体外培养的HT－1080后发现:其TLR2的基因表达量高于空白对照组，其最高表达量高于单用同剂量AngⅡ刺激组的表达量(P＜0.05)。见表3、图4。

表3 TGF－β的抑制剂Decorin在AngⅡ对TLR2基因调控中的影响

3 讨论

AS的炎症浸润通常存在于动脉壁的内膜层和外膜层，作为动脉外膜的最主要组成细胞，人成纤维细胞在动物模型中参与了外膜炎性反应。有研究发现外膜成纤维细胞的激活可促使AS早期病灶的形成［5］。

AngⅡ和TLR2在AS的进展中都发挥了重要的作用，但二者在AS中之间存在何种关系还知之甚少。在关于肾素－血管紧张素系统在慢性环孢素肾病中作用的研究中Kyung等［6］发现，AngⅡ能促肾脏中的炎症因子表达，炎症细胞浸润以及TLR2mRNA和蛋白表达。

由以上研究结果，我们推测AngⅡ可促进体外培养的HT－1080中TLR2的表达。本课题前期实验也证实了AngⅡ能够上调体外培养的 HT－1080中 TLR2表达。

TGF－β是可由多种细胞分泌多效性细胞因子，在许多生物学过程中都具有重要作用，且发现TGF－β具有激活炎症反应和抑制炎症反应双重作用。在高血压的病理过程中TGF－β的转录及活化被提高，在AS的病理过程中TGF－β的转录即活化却被抑制，是什么原因造成TGF－β被抑制目前还不清楚。是否由于TGF－β在这两种疾病中的不同遭遇才诱使AngⅡ对这两种疾病产生不同的影响还未有可知。本实验发现TGF－β抑制剂Decorin增强了AngⅡ对TLR2基因表达，并且随着其浓度的增加作用越强，TGF－β直接刺激组观察到随着TGF－β浓度降低TLR2基因表达逐渐增强，由此我们推断TGF－β在低浓度时可与AngⅡ协同促进HT－1080中TLR2的表达。但另一方面，还需用AngⅡ与不同浓度TGF－β共同作用，这样才能更加准确地知道TGF－β的作用到底是通过AngⅡ，或其他因子实现的，还是直接影响了 TLR2。目前关于 TGF－β－AngⅡ－TLR2之间调节的具体机制和信号通路还十分模糊，需通过进一步的实验来证实。

1 Zhong JC，Heikki V，Eero M.AngⅡand vascular inflammation.Med Sci Monit，2005，11:194－205.

2 Dunzendorfer S，Lee HK，Tobias PS.Flow－dependent regulation of endothelial Toll－like receptor 2 expression through inhibition of SP1 activity.Circ Res，2004，95:684－691.

3 Kristina E，Jesper S，Göran K，et al.Expression of Toll－like Receptors in Human Atherosclerotic Lesions.Cir，2002，105:1158－1161.

4 Adam E，Peter S，Linda K.Curtiss Modulation of atherosclerosis in mice by Toll－like receptor 2.Clin Invest，2005，115:3149－3156.

5 胡维诚.外膜成纤维细胞的激活是动脉粥样硬化早期事件之一.中国动脉硬化杂志，2007，15:530.

6 Kyung OA，Sun WL，Can Li，et al.Influence of Angiotensin II on Expression of Toll－like Receptor 2 and Maturation of Dendritic Cells in Chronic Cyclosporine Nephropathy.Transplantation，2007，83:938－947.