壳聚糖胶囊对小鼠免疫功能的影响

★ 吴丹 余永红

(1.江西省药品审评中心 江西 南昌 330046;2.江西省食品药品检验所 江西 南昌 330029)

壳聚糖的免疫调节功能被广泛研究，壳聚糖灌胃处理可以使小鼠的胸腺指数和脾脏指数增高，细胞免疫、体液免疫、单核-巨嗜细胞功能和NK细胞活性增强[1,2]。黄俊民等研究表明壳聚糖能提高绵羊红细胞诱导的小鼠迟发型变态反应能力，增强小鼠的血清溶血素抗体反应和巨嗜细胞的吞噬反应[3]。壳聚糖胶囊为口服固体保健食品，其有效成分D-氨基葡萄糖盐酸盐含量大于85.1g/100g，本实验对其增强免疫功能进行了相关研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品 壳聚糖胶囊内容物。折合剂量0.033 3g/kg·bw(成人体重以60kg计)。

1.1.2 实验动物 昆明种雌性小鼠，200只，SPF级，重18～22g。购自江西中医学院动物实验中心(实验动物合格号：JZDWNO.2013-0137)。

1.1.3 主要仪器 分光光度计：722型，上海精科仪器有限公司；二氧化碳培养箱：MCO-20AIC，日本三洋电器集团；酶标仪：PT-3502，北京普天新桥技术有限公司；显微镜：BX53，奥林巴斯中国有限公司；24孔、96孔平底培养板和U型96孔培养板：上海卧宏生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物与分组 将200只实验动物随机分组：I(碳廓清)、II(腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞)、III(迟发型变态反应)、IV(脏体比值、半数溶血值和抗体生成细胞数的测定)、V(ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化、NK细胞活性测定)。每组设低、中、高剂量组及对照组。每组为10只小鼠[4]。

1.2.2 剂量选择及样品处理 按体重设0.167g/kg·bw(低)、0.333g/kg·bw(中)、1.000g/kg·bw(高)三个剂量，配制时分别取壳聚糖内容物1.67g、3.33g、10.00g用1%CMC定容至200mL，给小鼠灌胃(0.2mL/10g·bw)，对照组予以等体积的1%CMC，每天1次，连续灌胃30d[4]。

1.2.3 脏器重和体重测定 处死小鼠前称重，解剖取胸腺和脾脏并称重，计算胸腺/体重和脾脏/体重比值[4]。

1.2.4 迟发型变态反应(DTH) 用0.2mL的2%(v/v)SRBC对每只小鼠注射腹腔致敏，4d后测量左后足跖厚度，在测量部位用20μL的20%(v/v)SRBC对每只小鼠行皮下注射，于24h后再次测量左后足跖厚度，测3次取平均值，计算攻击前后足跖厚度之差[4]。

1.2.5 ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(MTT法) 无菌操作取脾置于Hank's溶液中制备细胞悬液，过200目筛；用Hank's溶液洗涤并离心(10min，1 000r/min)2次；将细胞移入1mL完全培养液中计数，再用RPMI1640溶液配制浓度为3×106个/mL的细胞液；分2孔加入24孔培养板，每孔1mL，一孔为5%CO2对照，另一孔加75μLConA(浓度为75μg/mL)液，37℃培养68h后从各孔小心吸去0.7mL上清液，再加0.7mLRPMI1640培养液(不含小牛血清)和MTT50μL(5mg/mL)，继续培养至72h；再往各孔加1mL酸性异丙醇，吹打混匀，溶解紫色结晶后分装至96孔板，各设3个平行样，570nm处测定OD1和OD2值，计算公式[4]：

R=OD1-OD2

R：淋巴细胞增殖能力；OD1：光密度(加ConA)；OD2：光密度(不加ConA)。

1.2.6 抗体生成细胞检测 用生理盐水(NS)洗涤羊血3次，每次离心(10min，2 000r/min)得压积SRBC，再用NS制备的2%(v/v)细胞悬液注射小鼠腹腔(每只0.2mL)，4d后，无菌取脾小心磨碎，用Hank's液制备浓度为5×106个/mL的细胞悬液；将溶解好的表层培养基与等量2倍浓度Hank's液(pH7.4)混合，以每试管0.5mL用量分装，再加50μL 10%(v/v)SRBC和20μL细胞悬液，迅速混匀，倾倒于制备好的琼脂糖玻片上，凝固好将玻片平扣于玻片架上，用CO2培养箱温育1.5h，在玻片凹槽中倒入补体(用SA液1∶8比例稀释)继续温育1.5h，计数溶血空斑[4]。

1.2.7 半数溶血值(HC50)的测定 用羊血制备0.2mL 2%(v/v)SRBC并注射小鼠腹腔进行免疫，4d后摘眼球以离心管取血，静置1h，离心(10min，2 000r/min)收集血清，用SA缓冲液稀释至200倍后取1mL到试管中，顺次加入0.5mL 10%(v/v)SRBC(SA配置)、补体1mL(用SA液1∶8比例稀释)；并设SA对照组。水浴37℃保温30min后冰浴终止反应，离心(10min，1 900r/min)，取1mL上清液和3mL都氏试剂到试管中，于另一试管中加0.25mL 10%(v/v)SRBC(SA配置)和3.75mL都氏试剂，混匀静置12min，在540nm处测OD值，对照作空白，计算公式[4]：

HC50=OD1值/OD2值×R

HC50：半数溶血值；OD1：样品OD值；OD2：SRBC半数溶血OD值；R：稀释倍数。

1.2.8 小鼠碳廓清实验 印度墨汁用NS稀释4倍，在小鼠尾静脉进行注射(0.01mL/g)，注射完立即计时，于第2min、10min分别从内眦静脉丛采血20μL，加入到2mL 0.1%Na2CO3溶剂中混匀；溶剂为空白对照，在600nm处测OD值。解剖小鼠取肝和脾称重，计算吞噬指数a[4]。

1.2.9 小鼠腹腔巨嗜细胞吞噬鸡红细胞实验 离心制备鸡红细胞(1 900r/min，离心10min)，用NS配置成20%(v/v)细胞悬液，取1mL注射小鼠腹腔，30min后处死以鼠板固定，从腹部中央剪开皮肤，注射2mL NS，转动鼠板约1min制备腹腔巨噬细胞洗液，取1mL滴于载玻片上，在保湿盒中温育后(37℃，30min)，以NS漂洗，晾干，以丙酮：甲醇(1∶1)溶液固定，再用4%(v/v)Giemsa-PBS液染色，再漂洗，再晾干，显微镜下计数(每个玻片计数100个)，计算公式[4]：

A%=B/C×100

A：吞噬率%；B：吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数；C：计数的巨嗜细胞数。

T=Y/C

T：吞噬指数；Y：被吞噬的鸡红细胞总数；C：计数的巨噬细胞数。

1.2.10 NK细胞活性的测定 处死小鼠后无菌取脾，脾细胞用Hank's液洗涤、离心(10min，1 000 r/min)2次，弃上清，加0.5mL无菌水，待红细胞裂解后(约20s)，再加0.5mL 2倍Hank's液和8mL Hank's液，离心处理(1 000 r/min，10min)，再重悬(用1mL含10%小牛血清的RPMI1640培养液)，用台酚兰染色计数；再将活细胞浓度调整至2×107个/mL，此为效应细胞，配制细胞浓度为4×105个/mL的YAC-1细胞作为靶细胞(RPMI1640培养液)；各取100μL(效∶靶=50∶1)到96孔U型板中培养，将培养液和靶细胞各100μL加到靶细胞自然释放孔中，将靶细胞和2.5%Triton各100μL加到靶细胞最大释放孔中，均需设3个平行样，37℃,5% CO2培养4h后离心(5min，1 500r/min)，取100μL上清液到96孔平底培养板中，并加LDH基质100μL，室温反应3～10min，各孔加1mol/L的HCL30μL，490nm处测定，计算公式[4]：

A=[(OD1-OD2)/(OD3-OD2)]×100%

A：NK细胞活性；OD1：反应孔OD值；OD2：自然孔释放OD值；OD3：最大释放孔OD值。

2 结果

2.1 对体重和脏器/体重比的影响 体重观测发现，各剂量组小鼠体重变化、脾脏/体重比及胸腺/体重比，与对照组比较无显著差异(P>0.05)。

2.2 对细胞免疫的影响 表1表明，高剂量组小鼠足跖肿胀程度显著高于对照组(P<0.01)，且能显著增加小鼠淋巴细胞转化能力(P<0.05)。

表1 对细胞免疫的影响

2.3 对体液免疫的影响 由表2可知，高剂量组能显著增加抗体生成细胞数和半数溶血值(P<0.05)。中、高剂量能显著增加NK细胞活性(P<0.05)。各剂量对小鼠单核-巨噬细胞能力和小鼠巨嗜细胞吞噬鸡红细胞能力无明显影响，与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。

表2 对体液免疫的影响

3 结论

实验研究表明，经口给予小鼠0.167g/kg·bw(低)、0.333g/kg·bw(中)、1.000g/kg·bw(高)三个剂量壳聚糖胶囊内容物30d，高剂量可以增加小鼠迟发型变态反应能力、淋巴细胞转化能力、抗体生成细胞数、血清半数溶血值，与对照组比较具有显著差异性(P<0.05或P<0.01)；中、高剂量能增加小鼠NK细胞活性，与对照组比较有显著性差异(P<0.05)；对小鼠体重增长、脾脏/体重比值、胸腺/体重比值及小鼠单核-巨噬细胞碳廓清能力、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力无明显影响(P>0.05)。提示该壳聚糖胶囊产品具有增强免疫力的功能。

[1]王晓玲．甲壳素和壳聚糖在食品工业中应用的新进展[J].食品研究与开发，2007，28(10)：163-166.

[2]雷朝亮，钟昌珍．蝇蛆几丁糖的免疫调节作用研究[J].华中农业大学学报，1997，16(3)：259-262.

[3]黄俊民，吴丽明，陈瑞仪．甲壳素和壳聚糖对小鼠免疫调节的研究[J].广东卫生防疫，1999，25(1)：4-6.

[4]中华人民共和国卫生部．保健食品检验与评价技术规范[M].北京：2003：961-1001.