青蒿素、哌喹、磷酸哌喹抗性系杀虫速度实验研究*

★ 郑绍琴 高岩 陈颖 陈沛泉 宋健平*

(1.广州中医药大学科技产业园有限公司 广东 广州 510445；2.广州中医药大学 广东 广州 510405)

根据最新情况估计，2010年约有2.19亿疟疾病例，不确定范围为1.54亿至2.89亿，有66万人死亡，不确定范围为49万至83.6万[1]。81%疟疾病例和91%死亡发生在世卫组织非洲区域。自2000年以来，全球疟疾死亡率已下降25%以上，世界卫生组织非洲区域降幅达33%。大多数死亡发生在非洲儿童中，平均每分钟就有一名儿童死于疟疾[2]。抗疟药的应用，是疟疾防治的重要手段之一，也是人类抗击疟疾的主要武器，在人类与疟疾的斗争中发挥了重要的作用。但是，抗疟药的现状并不乐观，抗药性疟原虫的出现，使得疟疾的防治工作面临困境[3]，即使是青蒿素这种目前应用于抗疟一线的短半衰期、高效、速效、低毒的抗疟药，2006在泰-柬边界常规药效检查中发现第一例恶性疟原虫对青蒿素类产生抗性的证据[3]，2009年，泰-柬边境确诊出现恶性疟原虫对青蒿素耐药，后来又在缅甸和越南等地发现同样情况[4]。疟原虫对抗疟药物的敏感性检测为抗疟药的合理使用与抗疟措施的制定提供依据。杀虫速度实验通常用于评价抗疟药杀灭疟原虫速度的快慢程度，本研究对培育出的抗药性虫系与敏感株进行杀虫速度实验，观察是否存在差异。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 疟原虫株 伯氏疟原虫K173(Plasmodium berghei K173，P.b.K173)株，1997年4月引自美国国立卫生研究院，血传与液氮冷冻交替进行保种。2012年12月3日复苏。

青蒿素抗性系由P.b.K173经大剂量复燃法抗性培育至35代得到，抗性指数I90为4.4，2012年12月3日复苏。

哌喹抗性系由P.b.K173经大剂量复燃法抗性培育至35代得到，抗性指数I90为43.0，2012年12月3日复苏。

磷酸哌喹抗性系由31代抗性系经大剂量复燃法继续培育至35代得到，抗性指数I90为103.5。磷酸哌喹31代抗性系由广州中医药大学热带医学研究所馈赠，2012年2月28日复苏。

1.1.2 实验动物与动物房 SPF级昆明小鼠，雌雄各半，鼠龄4～5周，体重(20±2)g，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK-(粤)2008-0020。

小鼠随机分组，自由进食、饮水，饲养在广州中医药大学科技产业园药理研究中心实验动物室，温度(20～25)℃，相对湿度(40～70)%，光照时间12h。

1.1.3 实验药物 青蒿素(Artemisinin，ART)购自广州汉方现代中药研究开发有限公司，批号100651，含量100.3%。

哌喹(piperaquine，PQ)购自广东新南方青蒿科技有限公司，批号110804，含量为100.5%。

磷酸哌喹(Piperaquine phosphate，PQP)购自重庆康乐制药有限公司，批号LPK-100302-M，含量为99.6%。

1.2 方法

1.2.1 实验方法 实验分为6个组，即：ART组、PQ组、PQP组、ART抗性系组、PQ抗性系组和PQP抗性系组，每组小鼠15只。给药剂量设为各药ED90的100倍，即：ART 4646mg/kg，PQ 335mg/kg，PQP 836mg/kg。

参照WHO Tech Rep Ser No.529(1973)的方法[5]，每组用各自种源鼠腹腔接种感染。每只试验鼠接种1×107个伯氏疟原虫感染的红细胞，当试验鼠疟原虫红细胞感染率达到10%左右时灌胃给药一次，给药后每6h取尾血涂片镜检，连续观察48h。

1.2.2 评价指标 查血片计算小鼠红细胞原虫感染率(%)，查完2×104个红细胞未见原虫者定为阴性。用直线回归方程计算原虫下降回归系数(b)和原虫下降50%和90%的时间(CT50和CT90)，并按下式计算原虫残存率(%)。

2 结果

2.1 敏感株对P.b.K173杀虫速度实验结果

PQ与PQP使原虫下降速度大致相同，CT50/CT90分别为13.34h/32.16h、13.91h/34.47h，；ART的CT50/CT90为17.38 h/38.79 h。

表1 ART、PQ和PQP对P.b.K173株给药后不同时间原虫密度变化

表2 ART、PQ和PQP对P.b.K173株的杀虫速度

2.2 抗性系对P.b.K173杀虫速度实验结果 35代ART抗性系杀虫速度的CT50/CT90为15.32h/40.21h；PQ、PQP抗性系在48h杀虫速度实验过程中，其原虫感染率呈现逐渐升高的趋势，至第48h，其感染率(20.54±3.62)%、(23.90±2.60)%明显高于药前的(9.98±1.49)%、(9.91±0.87)%。

图1 ART、PQ和PQP对P.bK173杀虫速度实验

表3 ART、PQ和PQP抗性系对P.b.K173株给药后不同时间原虫密度变化

表4 ART抗性系对P.b.K173株的杀虫速度

图2 ART、PQ和PQP抗性系对P.bK173杀虫速度实验

图3 抗性系与敏感株对P.bK173杀虫速度实验

3 讨论

杀虫速度实验通常用于评价抗疟药杀灭疟原虫速度的快慢，本实验选择具有重度抗性(I90为103.5)的磷酸哌喹抗性系作为参照组，与具有轻度抗性(I90为4.4)的青蒿素抗性系、中度抗性(I90为43.0)的哌喹抗性系进行48h杀虫速度实验，结果显示，具有轻度抗性的青蒿素抗性系与其敏感株在杀虫速度方面没有显著差异；而具有中度抗性的哌喹抗性系与其敏感株在杀虫速度方面则存在较显著的差异，具有重度抗性的磷酸哌喹抗性系与其敏感株在杀虫速度方面存在的差异与哌喹相同，提示抗性系与敏感株在杀虫速度方面存在的差异并不是偶然现象。这一结果也容易理解，未产生抗药性的疟原虫对抗疟药具有一定的敏感性，体现在杀虫速度上，即原虫感染率或原虫残存率随时间变化呈现出下降的趋势甚至为0；而对于培育出的抗性虫系，由于疟原虫对抗疟药产生了一定程度的耐药性，使得药物对原虫的敏感性在逐步下降，体现在杀虫速度上，即原虫感染率或原虫残存率随时间变化呈现出逐步上升的趋势，药物没能对疟原虫起到相应的杀灭作用，原虫按其生长周期继续进行繁殖。

本实验结果提示，根据抗性系与敏感株在杀虫速度方面存在的差异，可将48h杀虫速度实验作为抗疟药敏感性检测的一种方法来应用。

[1]WHO.Media centre. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs094/en/index.html，2013-03.

[2]WHO. Global estimates of malaria cases and deaths 2000-2009[M].World Malaria Report, 2011:72-74.

[3]Wongsrichanalai C, Pickard AL, Wernsdorfer WH, et al. Epidemiology of drug-resistant malaria. Lancet Infect Dis[J].2002,2(4):209-218.

[4]WHO. Malaria deaths are down but progress remains fragile.Geneva, 2011.

[5]World Health Organization. WHO Technical Report Series No:529[R].Geneva,1973.