口腔扁平苔藓病损区细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表达研究

满一 钟良军

·论著·

口腔扁平苔藓病损区细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表达研究

满一 钟良军

目的通过对口腔扁平苔藓病变发展过程中细胞凋亡状况和凋亡相关蛋白表达的研究，探讨扁平苔藓的发病机制。方法采用免疫组化SP法，分析正常口腔黏膜上皮25例，扁平苔藓组织25例中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达水平及分布差异。结果与正常黏膜比较，Bcl-2在口扁平苔藓固有层与上皮层均显过度表达(P<0.05)，随淋巴细胞聚集密度的增加，其在固有层表达强度也明显增强，并高于上皮层(P<0.05)。正常黏膜Bax弱表达局限于角化层，口腔扁平苔藓中Bax表达较正常组明显增强，随糜烂程度的加重，Bax表达明显增强(P<0.01)，分布更广泛。结论Bcl-2在扁平苔藓固有层中过度表达抑制了淋巴细胞的凋亡的，强化细胞免疫，Bax过度表达是对异常增殖的上皮细胞和免疫细胞的拮抗反应，试图通过诱导凋亡，恢复细胞数目的稳定和免疫的平衡，但是过度凋亡致糜烂萎缩皮损。

口腔扁平苔藓；Bcl-2；Bax

口腔扁平苔藓(oral lichen planus,OLP)是以红色扁平丘疹为皮损特点的黏膜性疾病。其组织病理改变包括表皮棘层不规则增生、基底细胞液化、真皮浅层过度的淋巴细胞的浸润，以及上皮层及真皮浅层变性的角质形成细胞(胶样小体)，说明免疫细胞与上皮细胞的凋亡平衡出现障碍。因此，通过对OLP细胞凋亡状况及凋亡相关蛋白的表达研究，探讨扁平苔藓的发病机制，有助于临床早起诊断和防治。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择中国石油天然气集团公司中心医院2006年11月至2009年3月收集的石蜡切片共50例。口腔扁平苔藓25例，包括非糜烂型15例和糜烂型10例，男9例，女16例；年龄31～77岁，平均年龄(39±9)岁；选取同期正常口腔黏膜25例，男11例，女14例；年龄38～77岁，平均年龄(49±16)岁。 所有检材诊断和组织学分型均依据WHO标准[1]，由同一名经验丰富的病理医生完成。

1.2 试剂 所有试剂均购至福州迈新生物技术有限公司。Bcl-2、Bax为即用型鼠抗人单克隆抗体，SP复合物MaxVisionTM为快捷即用型。DAB显色试剂盒为链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HPR)免疫组化染色EnVision系统，适用于链霉素-过氧化物酶免疫组织化学染色方法(streptavidin-peroxidase,SP)。

1.3 实验方法 采用免疫组化SP法染色检测细胞凋亡与增殖状况。所有组织切片经10%甲醛固定、常规脱蜡、透明、浸蜡、石蜡包埋。5 μm连续切片，固定于经多聚赖氨酸处理的载玻片上，常规组织切片脱蜡入水；微波加热10 min暴露抗原；3%H2O2溶液阻断内源性过氧化物酶活性10 min，PBS水冲洗，滴加Bcl-2(按比例稀释1∶80)、Bax一抗(稀释度1∶80)，37℃孵育60 min，加入SP复合物HRP-MarVisionTM，30℃孵育60 min，DAB缓冲液、DAB底物、DAB色原顺序加入、混匀成DAB显色液滴定组织切片，室温下显色10 min，显色后苏木素复染，常规脱水，二甲苯透明，封片。以PBS缓冲液(0.01 mol/L，pH值7.4)作Bcl-2、Bax的阴性对照，以迈新公司提供的淋巴瘤Bcl-2阳性片为阳性对照，胃癌阳性染色切片为Bax的阳性对照。

1.4 结果判定 采用HM2A8-2000彩色医学图文分析系统，每例每张切片各随机选取5个不重复、不重叠10×40倍高清视野，细胞质和细胞核染成棕色或棕红色颗粒或弥漫成片状为Bcl-2和Bax的阳性表达。计数视野中1 000个细胞的阳性细胞数。参照Hueber[2]标准，将Bcl-2和Bax定级为：(1)Bcl-2，未见阳性细胞着色为阴性(-)；阳性细胞数<10%为(+)；11%～25%为(++)；26%～50%为(+++)；>50%为(++++)。(2)Bax，阳性反应为棕色到棕红色颗粒或片状弥散定位于胞浆，高倍镜下计数：标本中无阳性细胞为0分，<25%为1分；26%～50%为2分；50%以上为3分，最后求其平均数。染色强度以棕色为1分，深棕色为2分，棕红色为3分。两者相乘，0分为阴性(-)，1～3分为弱阳性(+)，4～6分为中等阳性(++)，7～9分为(+++)。

1.5 统计学分析 应用SPSS 11.5统计软件，因每组样本数<40，组间凋亡指数采用单因素方差分析，组间Bcl-2、Bax阳性表达率差异采用Fisher精确概率法单因素相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 扁平苔藓与正常黏膜Bcl-2表达比较 扁平苔藓各组织中Bcl-2蛋白表达率均显著高于对照组(P<0.05 )；Bcl-2在扁平苔藓固有层中的阳性检出率达80.02%，明显高于其在扁平苔藓上皮层48.0%的表达率(P<0.05)。见表1。

表1 Bcl-2蛋白在口腔正常黏膜、扁平苔藓病损各组织中的表达 n=25，%

注：与对照组比较，*P<0.05；与上皮层比较，#P<0.05

2.2 扁平苔藓与正常黏膜Bax表达的比较 扁平苔藓各病理分期中Bax蛋白表达均显著高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 Bax在扁平苔藓组织中表达

注：与正常口腔黏膜比较，*P<0.05

3 讨论

本研究系统地观察了健康口腔粘膜与OLP各阶段病损区细胞凋亡状况，显示包括正常粘膜在内的所有上皮细胞均有Bcl-2、Bax表达。正常口腔黏膜中，上皮细胞Bcl-2阳性表达率为16%，主要分布在上皮基底细胞层及棘层，固有层罕见Bcl-2阳性表达淋巴细胞，表达程度较均一。Bax为弱阳性表达，点状散在分布于棘层等角化层，并且上皮各层次趋于完整，界面清晰，细胞结构基本未破坏，见图1、2。这符合黏膜上皮细胞分裂起源于基底层并逐渐向角化层移行成熟、衰老、凋亡的生理特征。Bcl-2适当表达可保证角质形成细胞分裂发生，完成连续的细胞周期。而当细胞周期完成即将通过凋亡发生克隆消失时，Bcl-2的表达则下调，Bax代偿性升高，促进细胞凋亡，以保持细胞数目的动态平衡及维持粘膜上皮的分层结构。

Bcl-2蛋白过表达，则细胞寿命延长，数量累积。实验结果统计显示：扁平苔藓上皮细胞中Bcl-2阳性细胞表达率48%，中等强度以下的阳性染色居多。扁平苔藓组织内自身对照，随固有层淋巴细胞聚集密度的增强，糜烂型Bcl-2阳性染色率跳跃式增加，在真皮浅层密集的淋巴细胞带，阳性检出率达80%，见图3、4，明显高于上皮层(P<0.05)，无论上皮层，还是固有层，扁平苔藓组织中的Bcl-2的表达率均高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。从皮损与Bcl-2阳性细胞分布之间关系上观察，多数病例(18例，72%)上皮层变性与Bcl-2阳性表达之间似有较明确的上下对应关系，既真皮浅层淋巴细胞Bcl-2特异免疫反应活跃区域，在其上方既可以出现上皮棘层楔形增厚，又能观察到基底细胞液化变性，基底细胞液化变性和细胞浸润呈真皮浅层不连续的带状分布；而当固有层Bcl-2阳性淋巴细胞连续性发生断裂时，只有点状、散在Bcl-2阳性细胞浸润时，基底层则趋于完整，棘层也无明显增厚。目前大多数研究认为口腔扁平苔藓发病与发展可能与T细胞免疫介导失衡相关[10]，其组织病理学上表现为上皮乳突层下淋巴细胞数量迁移、聚集。因此推测：(1)上皮基底层的液化变性并不是内在因素所致，而是Bcl-2活化后的淋巴细胞攻击和诱导。Bcl-2的过度表达抑制了淋巴细胞凋亡，加强特异性细胞毒性T细胞的活性，从而杀伤角质形成细胞，造成基底细胞液化。这种损伤主要是Tc细胞、NK细胞通过释放穿孔素致角质细胞液化变性[3]；(2)Bcl-2与生发中心的T细胞有高度的亲和力，Bcl-2在T淋巴细胞发育成熟期活性增强，过表达使自身反应性T淋巴细胞逃避了胸腺的阴性选择而持续存在[4]；(3)OLP中淋巴细胞的聚集可能受到Bcl-2激活趋化。被淋巴细胞破坏后的上皮细胞又可以产生RANTES(RANTES)、IL-6等炎性因子，而Bcl-2诱导活化后的T淋巴细胞受体对RANTES、IL-6敏感性增强，游走能力增强，吸引更多的淋巴细胞穿越血管内皮到达皮损区[5]。

除真皮层过度的淋巴细胞浸润外，在组织病理上OLP属于苔藓样界面皮炎，上皮增殖也是其特点。与正常口腔上皮比较，本实验也显示部分病例(18例，72%)中Bcl-2反应活跃区域，颗粒层楔形增厚，棘层不规则增厚，角化不全。据此推测，Bcl-2的过表达干扰了细胞正常分化，延长上皮细胞分裂周期，细胞个体寿命延长，“凋亡细胞”的继续生存影响细胞数量增加。对于细胞分化和凋亡的关系，有学者认为是两个不同的过程，也有学者认为是同一过程[6]。由于凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2生物学作用、表达分布与正常上皮细胞分化周期特征一定程度的扣合，因此推测口腔黏膜这一特定的鳞状上皮其分化和凋亡可能是同一过程，或至少存在着某种相同的途径。

扁平苔藓病理组织学的特点是上皮中既有增殖性改变，部分病例又有萎缩性表现。本实验显示25例口腔扁平苔藓中有20例Bax蛋白显过度表达，多着色于细胞质与胞外基质，阳性表达率与正常黏膜比较差异有统计学意义(P<0.05)，并且中等强度以上的阳性率明显增加。随病损程度的加重，特别是糜烂型扁平苔藓中Bax阳性表达率达到最高值(86%)。在组织中分布也更广泛，上皮棘层、颗粒层、固有层淋巴细胞浸润处均有弥散性分布，与Bcl-2表达分布有部分 “交叉覆盖”，见图5、6。相关的研究资料也证实扁平苔藓上皮中确实存在细胞凋亡现象，上皮层及真皮浅层变性的胶样小体，既是角朊细胞发生凋亡后形成的凋亡小体[7]。本实验观察到在其中3例萎缩性改变的病例中，表现出上皮细胞层次减少或界面模糊，部分上皮突消失，而Bax在此区域内的角质形成细胞上免疫反应强烈，其分布与萎缩性上皮改变的结果基本一致，见图7。因此我们推测Bax的表达代偿性升高，表明机体为了抑制过度生长的细胞群体而采取了一系列的自稳态机制，新生细胞开始启动了细胞自稳定机制，它试图通过Bax/Bax蛋白表达的强化而拮抗细胞异常增殖，促进异常增殖旺盛细胞包括免疫细胞的凋亡，从而维持细胞数目的稳定和免疫的平衡，而由于Bax的过表达，角质形成细胞迅速进入凋亡，表皮更替时间缩短，导致上皮糜烂萎缩。另外研究显示Bax蛋白阳性表达率在糜烂型扁平苔藓阶段达到最高值，而同一病理分期中，Bcl-2表达则有所下降，低于非糜烂型，Bax和Bcl-2在扁平苔藓组织中呈反向表达，说明扁平苔藓发展过程中存在促凋亡与凋亡抑制的相互倾轧倾向。

图1 Bcl-2染色在正常黏膜中的表达(SP×400)图2 Bax染色在正常口腔黏膜中的表达(SP×400)

图3 Bcl-2染色在糜烂型OLP组织中的表达(SP×400)图4 Bcl-2染色在非糜烂型OLP组织中的表达(SP×400)

图5 Bax染色在糜烂型OLP组织中的表达(SP×400) 图6 Bax染色在非糜烂型OLP组织中的表达(SP×400)

图7 Bax染色在非糜烂型OLP中的表达(SP×400)

关于细胞数目自稳定启动机制，Adams等[8,9]认为除Bax、Bcl-2和Bak，在Bcl-2凋亡蛋白家族中还有一个单BH3结构域蛋白，单BH3结构域蛋白Bim、Bmf能够与线粒体膜外的抗凋亡Bcl-2家族蛋白相互作用，其活性通过转录诱导、翻译后磷酸化、细胞骨架扣押等机制调节，从而结合并拮抗抗凋亡的Bcl-2家族蛋白来诱导细胞凋亡。当接到凋亡信号后，Bax与Bak在线粒体外膜聚集，形成允许细胞色素C通过的通道。在正常细胞中，Bim、Bmf被分别扣押在线粒体微管和肌球蛋白而保持无活性状态，磷酸化可以调节Bax的活性。

1 WHO Collaberating Center for Oral precancerous Lesions Definition of leukoplakia and related lesions: an aid to studies on oral precancer，1978，1016：90383.

2 Hueber A,Welsand G,Jordan JE,et al.Characterization of CD95 Ligand(CD95L) induced apopatosis in human being fibroblasts.Exp Eye Res,2002,75:1-8.

3 雷蕾,詹丽华,谭为霞，等.口腔扁平苔藓局部浸润淋巴细胞颗粒酶B和穿孔素蛋白表达与上皮凋亡的关系.第三军医大学学报，2011，102:105.

4 Bogner C,Dechow T,Ringshausen I.Immunotoxin BL22 induces apoptosis in mantle cell lymphoma(MCL) cells dependent on Bcl-2 expression.CellBiol,2010,10：1365-1371.

5 Massari L,Pripic E,Kastelan M,et al.Perforin expression in peropheral blood lymphocytes and skin-infiltrating cells in patients with lichen planus.Bri J dermatol，2004，151:433-439.

6 Gannecchini M,Innocenzo B,Pesi R，et al.2-Deoxyadenosine cause apoptosis cell death in a human colon carcinoma cell line.Biochem Mol Toxicol,2003,17:329-337.

7 Reed JC,Matsuyama S.Bcl-2 family proteins and mitochondria.Biochim Biophys.Acta,1998,1366:127-137.

8 Adams JM.Ways of dying multiple pathways to apoptosis.Genes Dev,2003,17:2481-2495.

9 Villunger A,Michalak EM,Coultas L,et al.p53- and drug-induced apoptotic responses mediated by BH3-only proteins puma and noxa.Science,2003,302:1036-1038.

Studyontheexpressionofcellularapoptosis-proteinsBcl-2andBaxexpressioninorallichenplanus

MANYi*,ZHONGLiangjun.*DepartmentofStomatology,CentralHospitalofChinesePetroleumandNaturalGasCorporation,Hebei,Langfang065000,China

ObjectiveTo explore the pathogenesis of oral lichen planus(OLP) through examining the expression of apoptosis-associated protein Bcl-2 and Bax in OLP.MethodsThe expression levels and distribution of Bcl-2 and Bax were detected by immunohistochemistry(SP) in 25 cases of normal mucosa and 25 cases OLP tissues.ResultsAs compared with that in normal mucosa,overexpression of Bcl-2 was found in lamina propria and epithelial lining of OLP(P<0.05),the expression levels of Bcl-2 in lamina propria of OLP were increased with the increase of lymphocyte aggregation dencity,which were significantly higher than those in epithelial lining of OLP(P<0.05).The weak expression of Bax in normal mucosa was limited in cuticular layer,however,the expression levels of Bax were increased,as compared with those in normal mucosa,moreover,which were further increased with the aggravation of erosion degree(P<0.01),and its distribution was more wide.ConclusionThe overexpression of Bcl-2 in lamina propria of OLP inhibits apoptosis of lymphocytes and strengthens cellular immunity.The overexpression of Bax is antagonism reaction to epithelial cells and immunocyte of abnormity proliferation,which try to recover stabilization of cell number and immune balance by inducing cell apoptosis,however,excess apoptosis can result in erosion,atrophy,skin injury in OLP.

oral lichen planus; Bcl-2; Bax

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.11.007

065000 河北省廊坊市，中国石油天然气集团公司中心医院口腔科(满一)；杭州师范大学医学院口腔医学系(钟良军)

R 25

A

1002-7386(2014)11-1623-04

2013-11-26)