急性一氧化碳中毒对大鼠脑血管α-肌动蛋白和β-淀粉样蛋白的影响

谭清坡 田占坤 赵永芳 王迎霞 王欣 郭文杰 高三花

·论著·

急性一氧化碳中毒对大鼠脑血管α-肌动蛋白和β-淀粉样蛋白的影响

谭清坡 田占坤 赵永芳 王迎霞 王欣 郭文杰 高三花

目的通过对一氧化碳中毒大鼠脑内小血管壁结构变化的研究，探讨一氧化碳中毒后脑组织的血管壁结构的变化规律，可能为阐明迟发性脑病的发病机制提供线索。方法免疫组化和图像分析法，动态观察一氧化碳中毒大鼠脑内小血管壁α-肌动蛋白和β-淀粉样蛋白。结果与对照组相比，急性一氧化碳中毒大鼠的小血管壁中α-肌动蛋白、β-淀粉样蛋白均有显著改变(P<0.05)。结论α-肌动蛋白、β-淀粉样蛋白在一氧化碳中毒大鼠脑组织的血管壁结构变化中起着重要的作用。

一氧化碳中毒；α-肌动蛋白；β-淀粉样蛋白；大鼠

一氧化碳是生产生活中最常见的化学性窒息性气体之一[1]。部分一氧化碳中毒患者回复正常或接近正常后，可能表现以痴呆为主的急性精神症状，临床称为“迟发性脑病”，致死率和致残率都很高，预后较差。迟发型脑病发病机制尚不十分清楚，脑血管损害是其主要原因。α-肌动蛋白和β-淀粉样蛋白在血管构建中其重要作用，本研究通过动态观察CO中毒大鼠脑内α-肌动蛋白、β-淀粉样蛋白的变化情况，进而研究CO中毒大鼠脑组织血管壁结构的变化规律，以期为迟发性脑病的发病机制提供依据。

1 资料与方法

1.1 仪器与药品 光学显微镜，日本OLYMPUS BX51T-PHD-J11；电子透射显微镜，德国JEM-2000Ex；多功能彩色图像分析系统，美国Image-Pro Plus6.0。α-肌动蛋白抗体、β淀粉样蛋白抗体、免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物公司。99.9%CO气体(市售)。

1.2 动物及分组 清洁级健康SD大鼠108只，雄性，体重180～220 g，河北省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀) 2008-1-003。实验前1周适应性饲养，自由进食饮水。动物随机等分为空气对照组和染毒组，每组按时间点各设9个亚组：6 h、1 d、2 d、3 d、4 d、7 d、14 d、21 d、28 d，每个亚组6只大鼠。

1.3 标本制备及免疫组化检测 单次腹腔注射式染毒法建立CO中毒大鼠模型，对照组腹腔注射等量空气[2]。动物经10%水合氯醛(300 mg/kg，腹腔注射)麻醉后，打开胸腔，行左心室灌流，4%多聚甲醛固定。依各个时间点灌注、固定后取苍白球区脑组织置恒冷切片机中连续切片，切片厚20 μm。脑片经水化、抗原修复，分别加入α-肌动蛋白(1∶100)、β淀粉样蛋白(1∶200)。按试剂盒操作说明，依次加入生物素标记的二抗、三抗，DAB显色，梯度酒精脱水，二甲苯透明、封片。检测不同时间点α-肌动蛋白、β-淀粉样蛋白的表达情况。

1.4 图像分析 采用美国Imagepro-Plus 6.0软件图像分析系统，高倍镜下( 10 × 20) 每张切片分别选取外径相近、圆整小动脉各5个，测定测试区域阳性产物的灰度值(GA)和面积(n)及背景的灰度值(GB)和背景面积(m)。利用免疫组化定量计算公式：PU=|GA-GB|/Aα×Gmax×100，计算阳性单位(PU)值。Aα为阳性产物在所选区域中的面积密度，Aα=n/(m+n)；Gmax为图像分析系统的最大灰度分级，为256。

2 结果

2.1 大鼠CO中毒后α-肌动蛋白变化 对照组血管壁上可见α-肌动蛋白阳性表达，不同时间点表达情况未见明显变化。染毒组亦可见α-肌动蛋白表达，PU值先低后高呈V型变化，2 d时PU值表达最低，显著低于同期对照组(P<0.05)，21 d时PU值表达最高，显著高于对照组(P<0.01)。见表1。

表1 CO染毒大鼠脑组织血管α-肌动蛋白PU值表达变化比较

组别PU值6h1d2d3d4d7d14d21d28d对照组24.1±3.424.4±3.024.8±2.824.4±4.024.4±4.023.9±3.224.3±3.324.6±3.124.5±3.6染毒组22.7±3.221.9±2.020.8±3.2*22.8±3.423.1±3.225.8±3.026.9±3.532.6±3.2#32.0±3.6#

注：与对照组比较，*P<0.05，#P<0.01，

2.2 大鼠CO中毒后β-淀粉样蛋白变化 对照组各个时间点血管壁均无阳性表达。染毒组3 d后β-淀粉样蛋白表达显著增高，中期达峰值。与对照组相比，中毒组3～21 d β-淀粉样蛋白表达显著增高(P<0.05)，至28 d时β-淀粉样蛋白表达呈阴性。见图1～3。

图1 染毒组β-淀粉样蛋白PU值表达变化

图2 对照组14 d β-淀粉样蛋白(HE×400) 图3 染毒组14 d β-淀粉样蛋白(HE×400)

3 讨论

血管由外膜、中膜和内膜构成，中膜平滑肌细胞是构成血管壁的主要细胞，在血管活性和血管壁重构中发挥重要作用。平滑肌细胞表达增多及表型的改变，导致多种心脑血管疾病的发生。α-肌动蛋白被认为是平滑肌细胞表型转化的标志物，正常生理条件下，平滑肌细胞体积较小，α-肌动蛋白含量较多；病理改变时，细胞向合成型转变，细胞体积增大，分泌增殖能力增强，α-肌动蛋白含量减少。本研究以α-肌动蛋白为指标，观察了CO中毒大鼠小动脉平滑肌细胞α-肌动蛋白表达情况，研究发现，作为平滑肌增殖分化标志之一的α-肌动蛋白染毒后2 d达到最低点，并逐渐增大至

第21天达到高峰。结果表明在CO中毒初期，由于缺血缺氧等刺激因素，平滑肌细胞增殖分泌增加，表现出向合成型转变，后期随着损伤因素的缓解，增殖增生可得到缓解，细胞恢复为收缩型。

β-淀粉样蛋白表达异常表达会导致阿尔茨海默病的的发生发展[3，4]。新的研究表明，在脑缺血的损伤过程也表现出β-淀粉样蛋白表达异常。研究发现，脑缺血缺氧可以通过多种途径影响脑内β-淀粉样蛋白的生成和清除机制，导致β-淀粉样蛋白在脑内异常增多；慢性缺氧可导致β-淀粉样蛋白的生成增加[5，6]。β-淀粉样蛋白表达增多，可导致淀粉样血管病和阿尔茨海默病。CO中毒早期β-淀粉样蛋白的出现，可能是与缺氧导致β-淀粉样蛋白的生成及清除机制失衡有关。随着大脑清除β-淀粉样蛋白机制的恢复，β-淀粉样蛋白逐渐减少直至消失。本研究首次发现β-淀粉样蛋白在CO中毒大鼠脑组织的异常表达，且表达峰值出现在染毒后7～14 d，与迟发型脑病的“假愈期”相吻合，提示β-淀粉样蛋白的异常沉积可能是导致与迟发型脑病发生发展的原因之一。

1 Raub JA,Mathieu Nolf M,Ham P NB,et al.Carbon monoxide a public health perspective.Toxicology,2000,145:1-14.

2 王苏平,田占坤,王晓虹,等.急性一氧化碳中毒大鼠脑内小血管壁结构的变化.中风与神经疾病杂志,2012,29:343-345.

3 Vardy ER,Catto AJ,Hooper NM.Proteolytic emeehanisms inamyloid- beta metabolism: therapeutic implications for Alzheimer’s disease.Trends Mol Med，2005， 11: 464- 472.

4 Yamaguchi H,Yamazaki T,Lemere CA,et al.β- amyloid is focally deposited within the outer basement membrane in the amyloid angiopathy of Alzheimer＇s disease.An immunoelectron microsco pic study.AM J Pathol，1992,141:249-259.

5 Effect of hypoxia/ischemia and hypoxic preconditioning/reperfusion on expression of some amyloid-degrading enzymes.Ann N Y Acad Sci，2004，1035:21-33.

6 郑莹，闫福岭.脑缺血对脑内β-淀粉样蛋白清除的影响.中国脑血管病杂志，2007,4:186-190.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.11.015

061036 河北省沧州市，中国人民解放军空军95809部队医院(谭清坡)；河北省任丘市人民医院内三科(田占坤、赵永芳、王迎霞、王欣、郭文杰)，中西医结合科(高三花)

田占坤，060000 河北省任丘市人民医院； E-mail:tianxia.643@163.com

R 135.1+4

A

1002-7386(2014)11-1643-02

2013-12-11)