Axl基因在喉癌细胞Hep-2中的表达及意义

陈广理，龚树生，陈 沛，罗凌惠

Axl基因在喉癌细胞Hep-2中的表达及意义

陈广理1，龚树生2，陈 沛3，罗凌惠3

目的研究Axl 基因在喉癌细胞Hep-2中的表达，探讨Axl 基因与喉癌细胞的增值、浸润及转移的关系。方法提取Hep-2和人永生化表皮细胞Hacat细胞RNA，应用RT-PCR检测Axl mRNA的表达；应用免疫细胞化学染色检测Axl蛋白质在细胞Hep-2和Hacat中的表达。结果Axl mRNA在Hep-2细胞中高表达，平均相对积分吸光密度值为：0.8601±0.0409；Axl mRNA在Hacat细胞中低表达，平均相对积分吸光密度值为：0.2637±0.0503，差异有统计学意义(t=18.682,P<0.01)。免疫细胞化学染色表明Axl在Hep-2细胞中高表达，平均吸光密度值为：0.2621±0.0238；在Hacat细胞中低表达，平均吸光密度为：0.0729±0.0201，差异有统计学意义(t=25.938，P<0.01)。结论Axl与喉癌细胞Hep-2的增值、浸润及转移有密切关系。

Axl 基因；Hep-2；Hacat；RT-PCR

Axl (Anexelekto) 属于酪氨酸激酶家族，在多种肿瘤组织中过度表达，并与肿瘤细胞增殖、恶性程度、转移和不良预后相关。Axl抑制肿瘤细胞凋亡，调节内皮细胞增殖、迁徙及存活，参与肿瘤性血管生成，Axl与肿瘤侵袭、转移有密切关系[1]。喉癌具有浸润和转移能力，本实验研究Axl在喉癌细胞Hep-2中的表达，探讨Axl与喉癌细胞的增生、浸润及转移的关系。

1 材料与方法

1.1主要试剂和仪器RPMI1640培养基(Hyclon)，胎牛血清(Sigma)，TRIzol试剂(Gibco),逆转录酶MLV(MBI)，TaqDNA聚合酶(MBI)，dNTP(MBI)，Axl单克隆抗体为小鼠IgG (Zymed)，二抗体(Zymed)，PTC200 PCR仪(MJ Research)，DU650型紫外光分光光度仪(BECKMAN)，GDS8000型凝胶成像系统(UVP)，Grab-it 4.0分析软件为Gelworks 1D interdiate。

1.2细胞培养人喉癌细胞Hep-2和正常永生化表皮细胞Hacat用含10%的胎牛血清和RPMI1640培养基培养。培养箱内条件为37℃，5%CO2。2 d传代1次。

1.3引物设计见表1。

表1 引物序列表

1.4细胞RNA提取将长满约90%细胞(约5×106的细胞)的100 mm培养瓶置于冰上，吸去培养液，直接加入1 mL TRIZOL试剂，反复吹打。然后按说明用氯仿和异丙醇逐步提取RNA，溶于焦碳酸二乙脂水中，用紫外分光光度仪检测定量。

1.5PCR扩增cDNA合成按MBI公司的合成cDNA逆转录试剂说明进行。以cDNA为模板，扩增β-actin (300 bp)及Axl (202 bp)等基因片断。PCR反应Axl和β-actin引物在同一EP管中进行。反应体系(25 μL)中含cDNA 2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，Mg2+2.0 mmol，dNTP 0.2 mmol，上游和下游引物各0.2 μmol，TaqDNA聚合酶1 U。Axl的反应条件为：95℃ 5 min，95℃ 1 min、50℃ 1 min、72℃ 1 min，共34循环然后72℃延伸5 min。取5 μL产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并用grab-It系统成像，然后分析各条带的积分吸光密度值，以目的基因对β-actin的相对积分吸光密度值记录结果。

1.6免疫细胞化学染色在培养板内爬满各20张盖玻片的Hep-2和Hacat细胞，用丙酮固定(丙酮：无水乙醇=1∶1)10～15 min。采用SP法作perlecan免疫细胞化学染色。抗Axl单克隆抗体1∶100稀释，DAB显色液显色，呈棕黄色着色，以正常小鼠血清代替一抗体为阴性对照。实验结果观察：每张玻片分别在Olympus双目显微镜下放大200倍，随机选取5个视野通过HAPIAS-1000型全自动图像分析仪，分析各张玻片的Axl的平均吸光密度值。

1.7统计学分析统计学分析用SPSS 17.0软件，用两个独立样本的t检验分析Axl mRNA和蛋白质在Hep-2细胞与在Hacat细胞表达差异，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1AxlmRNA在Hep-2和Hacat细胞中的表达在Hep-2细胞中Axl mRNA (202 bp)高表达，平均相对积分吸光密度值为：0.8601±0.0409；Axl mRNA在Hacat细胞中低表达，平均相对积分吸光密度值为：0.2637±0.0503(图1)。差异有统计学意义(t=18.682，P<0.01)。

泳道 M：Marker；泳道 1 ：Axl mRNA在Hep-2细胞中的PCR产物(202 bp)，β-actin (300 bp)；泳道 2：Axl mRNA在Hacat细胞中的PCR产物(202 bp)，β-actin (300 bp)。

图1AxlmRNA在Hep-2和Hacat细胞中的表达

2.3Axl免疫细胞化学染色改变Axl在Hep-2细胞中高表达，分布于细胞的胞浆和部分胞核(图2)，平均吸光密度值为：0.2621±0.0238；Axl在Hacat细胞的胞浆和胞核弱表达或不表达(图3)，平均吸光密度为: 0.0729±0.0201；差异有统计学意义(t=25.938，P<0.01)。

图2 Axl在Hep-2细胞中高表达，分布于细胞胞浆和部分胞核(SP，×400)

图3 Axl在Hacat细胞低表达(SP，×400)

3 讨论

喉癌发病率占全身恶性肿瘤的5.7%～7.6%，在耳鼻喉科领域中仅次于鼻咽癌和鼻腔、鼻窦癌，居第3位，好发年龄为50～70岁。我国以东北地区发病率最高，男性居多，其病因尚不十分清楚。Axl属于酪氨酸激酶家族，Axl的配体是由生长停滞特异性基因6(Growth arrest specific gene 6)所编码的蛋白分子Gas6。因Axl其特殊的结构,既有黏附分子的特点，又具有酪氨酸激酶活性。研究发现Axl/Gas6活化系统在细胞的黏附与识别、增殖、抗凋亡中有重要作用。Axl在多种肿瘤组织中高表达，与肿瘤细胞增值、浸润、转移密切相关[1]。

本实验表明，Axl在喉癌细胞中高表达，在正常细胞中低表达，喉癌细胞的快速生长、浸润及转移可能与Axl的高表达有密切的关系。主要发生机制讨论如下。

3.1Axl抑制肿瘤细胞凋亡Axl与Gas6结合所引发的信号通路能够抑制细胞凋亡,并具有使细胞发生转化的能力。在正常情况下，Axl没有分裂原活性，当Axl过度表达时,Axl的分裂原活性就会表现出来，使细胞过度增殖，抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤形成。Sawabu等[2]研究表明，在胃癌中Axl和Gas6高表达，并且启动了下游磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶信号通路，抑制胃癌细胞凋亡，促进胃癌细胞过度增殖。结合本实验结果，Axl在喉癌Hep-2细胞中高表达，可能是Axl抑制喉癌细胞凋亡，促进了喉癌细胞的增殖。

3.2Axl促进肿瘤新生血管形成的作用肿瘤新生血管生成是肿瘤生长的前提,其与多种生长因子有关,其中血管内皮生长因子VEGF是促进作用最强的因子之一。Holland 等[3]研究表明，Axl调节内皮细胞增殖、迁徙及存活，参与肿瘤性血管生成,并且 Axl在肿瘤中高表达，与VEGF协同促进肿瘤新生血管的生成，促进肿瘤细胞的侵袭能力。结合本实验结果，Axl在喉癌细胞中高表达，可能与Axl与VEGF共同促进喉癌的新生血管生成有关。

3.3Axl促进肿瘤的增殖、浸润和转移侵袭与转移是恶性肿瘤本质特征，与细胞黏附分子表达的改变及基质的降解密切相关。在多种癌细胞中受体酪氨酸激酶Axl都过度表达，Axl在肿瘤细胞的增殖和侵袭过程中发挥作用。TaiK等[4]研究发现当癌细胞大量表达Axl时，会促进肿瘤细胞基质金属蛋白酶MMP-9的表达,加速分解基底膜及细胞外基质，促进癌细胞侵袭和转移。Mishra等[5]研究发现转移性前列腺癌细胞株PC3和DU145L中Axl高表达，低转移性癌细胞系LNCaP中Axl是较低表达，表明Axl在前列腺癌转移中起着重要的作用。Lee等[6]研究中Axl表达可促进口腔鳞状细胞癌发病和进展。Axl表达是鳞状细胞癌侵袭性和临床转归的一个有价值的标志物。临床上喉癌是具有极高浸润和转移能力的肿瘤，结合本实验结果，Axl在喉癌细胞中高表达，提示Axl可能促进了喉癌细胞的增殖、浸润和转移。

总之，本文通过检测Axl在喉癌细胞中的高表达，提示了Axl与喉癌的生长、浸润及转移可能有密切关系。Axl表达是喉癌侵袭性和临床转归有价值的标志物之一。由于受体酪氨酸激酶Axl过表达与多种疾病有关，因此Axl可成为诊断肿瘤的指标之一，是治疗肿瘤的重要靶分子。通过抑制或阻断Axl在肿瘤组织中的表达在抗肿瘤的治疗中可能有重要的价值。

[1]Hutterer M,Knyazev P,Abate A,et al.Axl and growth arrest specific gene 6 are frequently overexpressed in human gliomas and predict poor prognosis in patients with glioblastoma multiforme[J].Clin Cancer Res,2008,14(1):130-138.

[2]Sawabu T,Seno H,Kawashima T,et al.Growth arrest-specific gene 6 and Axl signaling enhances gastric cancer cell survival via Akt pathway[J].Mol Carcinog,2007,46(2) :155-164．

[3]Holland SJ,Powell MJ,Franci C,et al.Multiple roles for the receptor tyrosine kinase axl in tumor formation[J].Cancer Res,2005,65(20): 9294-9303．

[4]Tai KY,Shieh YS,Lee CS,et al.Axl promotes cell invasion by inducing MMP-9 activity through activity of NF-kappaB and Brg-1[J].Oncogene,2008,27:4044-4055.

[5]Mishra A,Wang J,Shiozawa Y,et al.Hypoxia stabilizes GAS6/Axl signaling in metastatic prostate cancer[J].Mol Cancer Res,2012,10(6):703-712.

[6]Lee CH,Yen CY,Liu SY,et al.Axl is a prognostic marker in oral squamous cell carcinoma[J].Ann Surg Oncol,2012,19(Suppl 3):500-508.

ExpressionofAxlinLaryngealCarcinomaCellHep-2anditsSignificance

CHEN Guang-li,GONG Shu-sheng,CHEN Pei,et al

(Third Affiliated Hospital,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

ObjectiveTo study the expression of Anexelekto (Axl) in human laryngeal carcinoma cells and its significance.MethodsIn this study,we investigated the expression of Axl mRNA in human laryngeal carcinoma cells,Hep-2 cells,using techniques of RT-PCR,and investigated the expression of Axl in the Hep-2 cells using techniques of immunohistochemistry.ResultsIt showed that the expression level of Axl and Axl mRNA significantly increased in Hep-2 cells as compared with the normal cells,Hacat cells (P<0.01).ConclusionThese data raise the possibility that Axl many play key roles in the growth,invasion and metastasis of human laryngeal carcinoma.

Axl；Hep-2；Hacat；RT-PCR

2014-05-31

1.洛阳东方医院耳鼻咽喉科，河南洛阳 471003 2.首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科，北京 100730 3.华中科技大学同济医学院附属协和医院耳鼻咽喉科，湖北武汉 430022

陈广理(1971-)，男，河南鄢陵人，副主任医师，从事耳鼻咽喉科基础与临床工作。

R739.65

A

1672-688X(2014)03-0170-03