HPLC法快速检测生物样品中溴敌隆

马红娟，徐志敏，杨 磊，刘小玲，李梅华，钟菊花，马锦琦

·法医学·

HPLC法快速检测生物样品中溴敌隆

马红娟1，徐志敏2，杨 磊1，刘小玲1，李梅华1，钟菊花1，马锦琦1

目的通过HPLC建立一种快速、有效的溴敌隆含量检测方法。方法分别采用甲醇、乙醇和丙酮提取血液检材中的溴敌隆，通过改变萃取溶剂，考察回收率，使用HPLC检测，比较提取效果。结果本法检测生物检材中的溴敌隆，在1～100 μg/mL时线性关系良好(相关系数R2=0.9973)；甲醇、乙醇和丙酮提取的加标平均回收率分别为78.5%，83.5% 和77.9%。结论本方法快速、有效，改进了生物检材中溴敌隆含量检测的法医毒物分析方法，也可应用于中毒病人的早期诊断。

HPLC；溴敌隆；血液

溴敌隆是第二代抗凝血剂灭鼠药，近年来虽有采用HPLC、LC-MS等方法检验溴敌隆，但是多为粮食、饲料等体外样品。经动物体内代谢或经体内组织提取、检测溴敌隆的方法少，且提取回收率较低，不能达到检测要求[2]，本研究通过HPLC建立一种快速有效的溴敌隆含量检测方法。

1 材料

1.1实验仪器与试剂仪器：Waters高效液相色谱仪，配有1525二元泵和 2487 二极管阵列检测器(美国 Waters 公司)；TG 328B 电光分析天平(上海天平仪器厂)；F8010AP无油真空泵(天津市科亿隆实验设备有限公司)。试剂：溴敌隆标准品(98.0%，德国Dr.公司)、甲醇、无水乙醇、丙酮均为HPLC级，磷酸、磷酸二氢钾等均为分析纯，实验用水来自Milii-Q纯水系统。实验动物：小白鼠20只(LD50组7只、半LD50组7只、空白组6只)购自本校动物中心。

1.2样品处理溴敌隆的小鼠LD50为0.21 mg/mL。实验组分别以LD50组、1/2LD50组，用灌胃法灌入溴敌隆稀释液，空白组灌喂生理盐水各0.4 mL，1周后统一处死，解剖取肝组织、胃组织、静脉血，对所得检材以直接提取法，分别用甲醇、乙醇、丙酮提纯萃取，萃取液浓缩、定容至500 μL。

1.3样品检测色谱条件：色谱柱为Symmetry®C18反相柱(4.6×150 mm，5 μm)；流动相：磷酸盐缓冲液(pH=3)：甲醇=0.18∶0.82；紫外检测波长：260 nm；进样量：10 μL；柱温：30℃。峰形良好，出峰时间为5 min左右，稳定性好[4]。

2 方法与结果

2.1标准曲线的绘制取溴敌隆标准品20 mg于容量瓶中，用无水乙醇定容至25 mL，得到浓度为0.8 mg/mL的储备液。用此储备液制成1、5、10、20、50、100 μg/mL的标准系列溶液，按照1.3条件进行测定，得到线性回归方程y=32311x+45324(r2=0.9973)。在确定浓度范围内，标准品溶液的浓度与峰面积成良好的线性关系。

2.2样品测定进样针准确抽取10 μL样品处理液在1.3条件下HPLC法检测，得到样品液的出峰时间与峰面积，得出结果见表1。

表1 不同样品中溴敌隆含量 μg/g

2.3精密度及回收率取空白血液添加溴敌隆标准品，分别用乙醇、甲醇、丙酮提取，提取液经检测计算平均回收率分别为83.5%、78.5%、77.9%。对同一样品重复检测，得到相对标准差RSD<10%。测得最低检测限16 ng/mL(s/n>3)。

2.4结论实验结果表明，乙醇、甲醇、丙酮均可对溴敌隆进行提取，但血液、肝脏用乙醇提取的萃取率高于甲醇和丙酮。

2 讨论

溴敌隆化学名是：3-(4-羟基-3-香豆素)-3-苯基-1-(对溴联苯基)-丙醇-1，其对很多种动物都有很强的毒性，可以通过消化道、皮肤和呼吸道吸收而导致中毒。溴敌隆的结构与维生素K相似，可在肝脏中与维生素K竞争，抑制凝血酶原和凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的生物合成，导致凝血障碍，其体内代谢产物亚苄基丙酮还可损害毛细血管壁，使其通透性增强，血液易渗出，导致大出血而死亡。其生物半衰期为6 d，最大效应在12～15 d，所以中毒后需要很长的治疗时间(通常2～4周)[1]。由于它作用缓慢、不易引起鼠类警觉、易歼灭鼠害的特点，而且具有适口性好、毒力强、靶谱广的特性，单剂量使用对各种鼠类都能有效防除。以此作为有效成分，配以溶剂、组溶剂及诱食剂等制成的灭鼠毒饵，常用于家庭、社区、公共场所等不同环境杀灭鼠害，容易发生误食等情况。由于初期症状不明显，常常被忽视，而不能尽早做出诊断，影响医治。

溴敌隆作为一种使用频繁、在机体内作用较慢的低毒鼠药，常有小儿误食等情况发生，其在中毒者体内含量不高，临床上往往因不能尽早做出诊断而影响医治。近年来虽有采用HPLC、LC-MS等方法检验溴敌隆，但是多为粮食、饲料等体外样品，经动物体内代谢或经体内组织提取、检测溴敌隆的方法很少。虽有齐孝蕊利用离子液体分散液相色谱微萃取技术提取检测生物检材中的溴敌隆[3]，但操作不易，不适宜快速检测。临床发生中毒事件后，常常需要在短时间内做出诊断，以利于尽早救治。本课题采用高效液相色谱法(HPLC)，用甲醇、乙醇、丙酮提纯、萃取检材，操作简便易行，配合适当的色谱条件，乙醇的加标平均回收率为83.5%，满足方法学要求，达到快速检测的目的。且方法成本较小，成熟后可应用于中毒患者的早期诊断。

[1]董天义，颜丙申.三种新抗凝血剂鼠饵防制家栖鼠实验室效果评价[J].医学动物防制，2004，20(6)：333-337.

[2]赵海雨，宋鸣.HPLC-ESI-MS/MS法测定全血中溴敌隆[J].刑事技术，2008，(5)：16.

[3]齐孝蕊，周海梅，吕坪，等.离子液体分散液相微萃取-HPLC检测血浆中溴敌隆[J].中国法医学杂志，2013，28(4)：282-283.

QuickDetectionofBromadialoneofBiologicalSamplesbyHPLC

MA Hong-juan,YANG Lei,LIU Xiao-ling,et al

(College of Forensic Medicine,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

ObjectiveTo establish a rapid and effective method for determining the content of bromadialone in blood,investigating the recovery to obtain the best treatment condition during changing the extraction solvents.MethodsUsing the methanol,ethanol and acetone to extract the bromadialone in blood samples respectively,and then compared the results of extraction by HPLC.ResultsUnder the conditions of this method,the good linear relationship was obtained in the range of 1～100 μg/mL(R2=0.9973);the average recoveries of extraction with methanol,ethanol and acetone were 78.5%,83.5% and 77.9% respectively.ConclusionThis method is rapid and effective for the detection of bromadialone and the improvement for the forensic toxicology analysis of bromadialone in biological samples,and also can be used for the early diagnosis of poisoning patients.

HPLC；bromadiolone；blood

河南科技大学大学生研究训练计划(2013228)

2014-07-28

河南科技大学法医学院，河南洛阳 471003

1.马红娟(1992-)，女，河南永城人，从事法医毒化研究。 2.义马市人民检察院，河南义马 472300

马锦琦，男，高级实验师，E-mail：hnrluccky@mail.haust.edu.cn

DF795.4

A

1672-688X(2014)03-0227-02