单氰氨诱导巨峰葡萄休眠解除过程中重要基因表达的差异

曹慕明，陈国品,李洪艳，韩佳宇，盘丰平，谢蜀豫，白先进，王 博，黄 露，文仁德

（1.广西农业科学院葡萄与葡萄酒研究所，广西 南宁 530007；2.广西大学，广西 南宁 530004）

对自然休眠进程调控是目前果树设施栽培中亟待解决的问题。利用药剂处理打破落叶果树休眠的研究国内不多，更缺乏应用于生产实践的报道。在国外，这方面的研究和应用较多[1-2]。应用化学物质打破葡萄休眠，促进植物反季节生产是研究的热点之一。国内外目前常用于打破休眠的化学物质有矿物油、含氮化合物、含硫化合物和生长调节剂，如氰氨基化钙、H2CN2、石灰氮、TDZ、GA3、6-BA和单氰氨等，都是很有效的破眠物质[3]。

随着单氰氨的逐步推广，研究单氰氨调控促进葡萄萌芽的生理效应以及分子作用机理方面已显得越来越重要，葡萄分子生物学研究也逐渐得到重视。

该研究在本课题组单氰氨诱导葡萄解除休眠技术以及生理机理研究[4-5]的基础上，以巨峰葡萄品种为材料，利用cDNA-SRAP技术分析葡萄在单氰氨调控作用下基因差异表达情况，进而探讨单氰氨调控葡萄萌芽的分子机理，为单氰氨的进一步推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

葡萄品种为巨峰葡萄，由广西农业科学院葡萄与葡萄酒研究所提供，为常规露地栽培模式。试验所需试剂、酶类、SRAP分析所用引物购自上海生工、Promega公司、Fermentas公司和 New Englad公司；药剂单氰胺购自宁夏大荣生物公司。

1.2 单氰氨处理及采样

对结果枝进行摘叶后，每树留枝（正常老熟）16～17条，每枝留8～10芽进行回缩修剪，之后用棉球浸蘸2.5%单氰氨溶液涂抹剪口芽以下的第一、第二芽（剪口芽不涂药）；对照枝条进行同样修剪，修剪后喷清水。

试验处理其它大田管理按正常的葡萄生产技术进行管理。处理后 0、12、24、36、48h分别对葡萄剪口芽以下的第一、第二芽进行取样，每次取样时处理和对照各取30个芽，取样后样品立即进行RNA分离或小心剥离芽体鳞皮，去污后经液氮速冻后贮存于-80℃备用。

1.3 模板的制备

1.3.1 总RNA的分离及其纯度和完整性检测

用于RNA提取和逆转录的溶液均用0.1%（体积分数）DEPC处理水配制；所用的塑料制品均用0.1%DEPC浸泡2d、高压灭菌并烘干后备用，玻璃器皿经200℃烘烤3h。

提取缓冲液：0.1mol/LTris-硼酸缓冲液（pH 8.0），其中含 30g/L CTAB，2.0mol/L NaCl，30mmol/L EDTA-Na2，5%β-巯基乙醇（用前加入）。12mol/L LiCl，氯仿，75%乙醇（DEPC处理 H2O配制）。其中H2ODEPCRS：含10%RNAsafe（天为时代公司产品）的DEPC处理H2O。DNaseⅠ（TaKaRa公司产品）。2×Taq PCR Oligo（Dt）18 primer，SRAP 引物以及Master Mix酶（上海生物工程有限公司）；反转录试剂购自TOYOBO公司。其余生化试剂苯酚、氯仿、无水乙醇、冰醋酸、Tris、EDTA、β-巯基乙醇、SDS均为国产分析纯，TAE缓冲液加0.1%DEPC处理12h后，灭菌后备用。

实验具体操作如下：

（1）向1.5mL离心管中加入600uL SDS提取液，60uL β-巯基乙醇，300uL Tris苯酚和 300uL氯仿，将葡萄叶片用液氮研磨后迅速加入离心管中（每管不超过0.2g材料），用旋涡震荡器剧烈震荡 3min，于 4℃低温，12000rpm，离心 5min。

（2）取上清液至1.5mL离心管中，加入等体积的氯仿，用旋涡震荡器剧烈震荡3min，于4℃低温，12000rpm，离心 5min。

（3）重复（2）1次。

（4）取上清液至1.5mL离心管中，向上清液中加入等体积的4M LiCl和上清液1/2体积的无水乙醇，混匀后放置冰上10min，于4℃低温，12000rpm，离心10min，小心弃去上清液，收集沉淀，用75%乙醇洗涤2次，无水乙醇2次，稍晾干。

（5）沉淀溶于适量DEPC水中，加入等体积的氯仿，用旋涡震荡器剧烈震荡3min，于4℃低温，12000rpm，离心 5min。

（6）重复（5）1次。

（7）取上清液至1.5ml离心管中，向上清液中加入2倍体积的无水乙醇，混匀后放置冰上10min，于 4℃低温，12000rpm，离心 10min，小心弃去上清液，收集沉淀，用75%乙醇洗涤2次，无水乙醇2次，稍晾干。

⑧沉淀溶于适量DEPC水中，-80℃保存备用。

取RNA样品4μL，用DEPC水稀释至1mL，混匀，在TU1800SPC紫外分光光度计测定230～280nm波长范围内的吸光值，并计算OD260nm/OD280nm和OD260nm/OD230nm比值，以检测样品的纯度。根据 RNA（μg/μL）=OD260nm×40mg/L×稀释倍数/1000，计算样品的RNA浓度。用1.0%琼脂糖凝胶在1×TBE（Tris硼酸EDTA）缓冲系统下进行电泳检测其完整性。

1.3.2 cDNA第一链的合成

cDNA第一链的合成是采用上海生物工程有限公司生产的M一MuLv（RNaseH一）进行的RNA反转录，参照M-MULV反转录试剂盒使用说明书，具体操作如下：

（1）在冰上加入下列反应混合物混合：

总 RNA（100nng/μL） 4μL

Oligo（Dt）18primer（50μΜ）2.5μL

DEPC处理水 Up to 30μL；

（2）离心3～5s，在70℃条件下保温5min后，迅速冰上冷却并加入下列成分：

5×反应缓冲液 6.0μL

10mM dNTPs 2.0μL

RNA 酶抑制剂（20∪/μL） 1.0μL

（3）离心3～5s，在37℃条件下保温5min后在冰上加入下列成分：

M-Mulv反转录酶（200∪/μL） 1.0μL

（4）混合，在42℃条件下保温90min，移入85℃保温10min，产物直接用于cDNA第二链合成或保存于-80℃备用。

1.3.3 cDNA第二链的合成

第二链的合成反应体系如下：

将上述反应混合液置于16℃条件下冰浴30min，加入 RNase H（60∪/μL）0.25μL混匀，16℃继续冰浴4h后转移到22℃保温2h，置换合成cDNA第二链。

1.3.4 cDNA的纯化

（1）加6倍体积的ddH2O到1倍体积的cDNA中，混匀。

（2）用等体积的氯仿抽提，12000rpm离心5min。

（3）取上清液，加入2倍体积的无水乙醇并置于-20℃环境中1h。

（4）混合液于12000rpm离心10min，弃上清，将沉淀溶于适量的ddH2O或TE（pH8.0）中。

1.4 SRAP-PCR扩增

根据L和Q等[6]设计SRAP引物序列方法，选用不同的3’端选择碱基，共设计了64条正向引物序列和64条反向引物，由上海生工合成。该实验选择性地选用了540对引物组合。

扩增体系和程序主要参考L和Q等[6]提供的方法，略加更改。PCR扩增反应体系如表1。

PCR反应程序按下列参数进行：

94℃预变性5min；

94℃ lmin，35℃ lmin，72℃ 1min，5个循环；

94℃ lmin，50℃ lmin，72℃ 1min，35个循环；72℃延伸 10min。

1.5 非变性丙烯酞胺凝胶电泳检测

电泳检测采用Budowle[7]和Bassan[8]的方法稍作修改后进行。配胶一灌胶一凝固一取梳子一电泳，本实验采用6%的聚丙烯酰胺凝胶包括：6%的聚丙烯酰胺、0.04%过硫酸胶、0.1%TEMED。

（1）扩增后的SRAP产物加入2μL上样缓冲液，上样量2μL，电泳缓冲液是0.5xTBE。在DYCz-30型电泳槽上进行，150mA恒流电泳35min。

（2）切断电源，取下胶板，剥下凝胶，放入300mL固定液中，轻轻摇动12min。

（3）倒掉固定液，加300ml染色液中，轻轻摇动12min。

（4）从染色液中取出凝胶，放入500mL的双蒸水中，漂洗1～2min，再转入双蒸水中漂洗1～2min；

（5）凝胶浸入显色液，轻轻摇动约5～8min，至出现清晰谱带。

（6）待凝胶完全显色后，读取cDNA片段大小（根据100bp DNA Marker确定）及带型。

1.6 SRAP二次扩增及电泳检

选择有差异条带出现的SRAP引物，进行二次扩增，体系与1.4相同，电泳检测与1.5相同。

1.7 聚丙烯酞胺凝胶回收差异片段

用改进的Maxam和Gilbert[9]的破碎浸泡法回收cDNA差异片段。步骤如下：

（1）用手术刀片把二次扩增具有同样差异的目的带切割下来。

（2）把切下来的胶片放入离心管中，用枪头在管中把胶片捣碎。

（3）估计碎胶片的体积，加入2倍体积的Elution Buffer。

（4）盖上盖子，常温下12h。

（5）在 4℃下，12000rpm 离心 10min，移上清液于另一个离心管中（注意不要带有凝胶碎块）。

（6）加0.5倍体积Elution Buffer于残渣中，轻轻涡旋2min，离心（同上）取上清移到原上清液的管中。

（7）用带有滤网的注射器把上清液中所有的凝胶残片过滤掉。

（8）用酚：氯仿（1∶1）200μL纯化提出的 DNA，（以除去SDS）离心（同上）取上清液于另一管中。

（9）用乙醇沉淀DNA，离心（同上），倒掉上清液，干燥后用200μL TE溶解DNA，及25μL的醋酸钠（3M），再加2倍体积的乙醇再次沉淀DNA。

（10）小心用70%的乙醇洗涤沉淀，干燥后用10μL TE 溶解 Cdna。

（11）作检测并进行随后实验（以原来的片段扩增带 Marker）。

1.8 回收片段再次扩增及检测

把1.7回收所得的片段，用相同的引物进行扩增，以备琼脂糖凝胶回收使用。体系扩大5倍，程序与1．6相同。所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，缓冲液为lxTAE，原回收cDNA片段为对照。

1.9 琼脂糖凝胶DNA回收

琼脂糖凝胶回收利用上海华舜生物工程有限公司生产的胶回收（小量）试剂盒（W5611）回收纯化目的片段，步骤如下：

（1）在W1洗脱液中加入48mL无水乙醇。

（2）割下含cDNA的琼脂糖块，使它尽可能小，放入1.5mL离心管中。

（3）按每100mg琼脂糖块加300μL SA液的比例加入SA液，100mg以下的凝胶加300μL凝胶裂解液SA，置40℃水浴10min，使琼脂块完全溶化，每2min颠倒混匀1次。

（4）将溶化后的琼脂糖移入吸附柱，12000rpm离心30s，倒掉收集管中液体，再将吸附柱放入收集管。

表1PCR扩增反应体系

（5）在吸附柱中加入500μL w1液，12000rpm离心15s，倒掉收集管中液体，将吸附柱放入收集管。

（6）在吸附柱中加入500μL w1液，静置1min后，12000rpm离心15s，倒掉收集管中液体，将吸附柱放入收集管。

（7）12000rpm 离心lmin。

（8）将吸附柱放入1个干净的1.5mL的离心管中，在吸附膜中央加入2mMTris30μL，静置1min后，离心 lmin，将 1.5mL的离心管（cDNA）贮存于-20℃。

1.10 目的片段的生物克隆

1.1 0.1 DH5a感受态的制备

采用《分子克隆实验指南》中所述氯化钙二次重悬法：

①从DH5a的LB平板上挑取1个单菌落接种于三角瓶中加20mL LB液体培养基。

②37℃、225rpm培养过夜至OD600=0.5左右。

③吸取200μL菌液接种于新鲜的20mL LB液体培养基中。

④37℃下 225～250rpm培养约 2.5～4h至OD600=0.5左右。

⑤将菌液转入1个50mL无菌离心管中，冰浴10min。

⑥5000rpm，4℃，离心 6min。

⑦弃上清液，用8mL冰预冷的0.lmol/L CaCl2轻轻重悬菌体至均匀。

⑧冰水浴30min。

⑨5000rpm，4℃，离心 6min。

⑩弃上清液，用冰预冷的0.lmol/L CaCl2轻轻重悬菌体至均匀。

⑪加无菌甘油至终浓度12.5%左右，分成每管100μL的小份，于-70℃保存备用。1.10.2 cDNA回收片段与pMD18.Tvector载体的连接

①在冰水浴上向一个500mL无菌离心管中混合以下试剂，总体积为10μL：

目的cDNA 4.5μL

②混合液于16℃连接10～12h或过夜。1.10.3 cDNA与PMD18-T Vector的连接产物转化DH5a感受态

①将10μL连接产物轻轻加入1管DH5a感受态中，轻轻混匀。

②冰水浴30min。

③42℃热激90s。

④迅速冰水浴2min。

⑤加入900μL室温LB液体培养基。

⑥37℃，180rpm复苏培养60～90min，同时在37℃预热一个LB/Amp平板。

⑦先在平板上涂布20μL X-gal和5μL IPTG。

⑧复苏时间到后取出试管，于5000rpm离心5min。

⑨吸去900μL上清液，用余下的100μL上清液重悬菌体至均匀。

⑩将重悬的菌体均匀涂布于平板上。

1.1 0.4 转化重组载体后的DH5a单斑菌液的培养和菌液PCR鉴定

①当转化目标cDNA片段的DH5a重组子的单斑在37℃培养18h左右，菌斑长至直径约2mm大小时，取出平板。

②将平板在4℃冰箱放置1h左右，待蓝白斑区分明显。

③用灭菌了的白色的移液枪枪头挑取白色的单菌斑于将有1mL LB液体培养基和5mmol AMP的1.5mL无菌离心管中。

④在37℃，225～250rpm的恒温培养箱中培养单斑菌液8～10h。

⑤以单斑菌液为模板，用与扩增目标片段时基本相同的条件，作目标片段的长度检测。

做菌液PCR检测时，反应体系和程序和生成目的片段的PCR反应一致。

⑥对菌液PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳及荧光染色检测。

1.11 重组克隆的反向Northern鉴定

采用Roche的地高辛标记和检测试剂盒（DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitlⅢ）进行杂交检测，方法按产品说明书。

（1）探针标记。取差减PCR产物1μL，加无菌去离子水15μL，PCR仪上98℃变性10min，立即冰浴10min。彻底混匀 DIG-High Prime，取 4μL加入变性样品中。短暂离心，37℃标记过夜，65℃加热10min，中止标记反应。

（2）菌落PCR产物斑点印迹膜制备。

①将带正电荷的尼龙膜裁成合适大小，将其置于滤纸上。

②在各菌落PCR样品中加入菌落PCR产物，在98℃变性10min，立即冰浴10min，将各管离心5s。

③用微量加样器吸取样品1μL点于膜上，使其晾干。点两张相同的膜，分别与正向和反向探针杂交。

（3）杂交与检测。方法按产品说明书。

1.12 阳性转化重组子的测序和序列的生物信息学分析

阳性克隆子的测序工作由上海英骏生物工程技术服务有限公司（Invitrogen，China）商业化完成，采用通用引物M13F/M13R组合起始测序。

序 列 对 比 在 NCBI（http：//www.ncbi.nlm.ih.gov/网站上进行。

2 结果与分析

2.1 模板制备

利用SDS法从葡萄的鳞芽中提取的总RNA，先在1500rpm、4℃离心去除葡萄组织，然后进行饱和酚抽提2遍后再用氯仿抽提，能有效减少RNA样品中多糖等次生代谢物的污染，提高RNA的质量。从电泳结果看（图1），利用该方法从葡萄的鳞芽中提取的RNA在琼脂糖凝胶电泳中28、18s和5s 3条带型清晰整齐，完整性好，无DNA污染，而28SrRNA带的亮度明显大于18s条带，泳道中无背景，未见蛋白质和多糖，没有明显的降解；样品的OD260/0D280介于1.8～2.0之间，说明该方法提到的总RNA中蛋白质污染很少，纯度较高，总RNA完整性好。

图1 总RNA（1、2葡萄芽总RNA）的电泳图

2.2 单氰氨调控葡萄基因的表达

2.2.1 电泳结果分析

在葡萄芽体萌动前分别利用单氰氨和清水进行处理，然后进行基因差异表达研究。结果表明处理和对照在聚丙烯酞胺变性凝胶电泳中显示条带都比较多，条带数量范围在5～20条之间，其中大多数在10条左右，处理和对照的电泳结果显示，在单氰胺作用下，葡萄的基因部分受诱导表达、部分受抑制，两者之间差异明显（图2）。

图2 电泳结果差异表达分析Marker：DL2000

2.2.2 单氰氨调控基因的筛选

我们利用540对引物组合对单氰氨处理和对照的葡萄芽体RNA混合池的样品进行差异表达分析，处理和对照共获得1200多条稳定条带，长度在50～500bP之间。2次PCR重复扩增重复率为62.7%，两次扩增在对照和处理混合池间表现相同的差异片段有10条，长度在50～500bP之间（图3）。经变性胶电泳展示后，对重复性较好的差异表达的片段进行回收分析。

图3 回收TDFs电泳检测1-11：回收 TDFs；Marker：DL2000

在综合分析各引物组合扩增产物的电泳展示结果的基础上，对部分扩增稳定、重复性好、差异较为明显的片段进行反向Northern杂交验证（图4）。反向Northern杂交结果分析发现：在杂交的10个样品中，6个差异明显，4个没有差异。这表明在所回收的差异片段中，假阳性条带占有较高的比例。

2.2.3 差异片段序列分析

图4 反向Northern杂交（上：处理；下：对照）

从反向Northern杂交结果阳性的TDFs中选取6个片段进行克隆和序列分析，并把它们BLAST比较的部分信息列于表2。从克隆所得的3个TDFs中Esc1的序列和数据库中的编码过氧化氢酶的基因序列具有较高的同源性；另外2个TDFs没有在NCBI数据库中找到相似的序列。

表2 部分差异片段序列分析结果

ATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTA TCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGG AAG（过氧化氢酶）

2个未知功能的克隆差异片段序列（Esc2、Esc3）

GTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAA CCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCC GGT

CTGAAACACTGCTGGTTGATTAACGTAGTT CTGAATATCAGGCGTGCCGGGTGATATGATAGG TACGTTGCTGTAACTATATTTTGAGAGCAGCAG TAAGACGCTCAGCATAAAATCATCTGTTGCAAT TCGTACGCAGGCAAATGGTCTGGCACTGGCCAA

3 讨论与结论

Halaly[10]展示了HC和HS处理对选定基因表达形式影响的比较研究，两种处理均诱导CAT、ADH和PDC的表达。然而，HS处理的葡萄芽中变化发生得较早，而HC处理的芽内侧更强烈。据研究在正常生长条件下，玉米CAT1在盾片、叶、上胚轴及未成熟果实内表达，CAT2主要在种子萌发后的盾片中表达[11]。Norflurazon（NF）诱导玉米CAT1、CAT2转录水平的提高主要发生在叶内，在盾片中无明显变化[12]。创伤诱导玉米CAT1、CAT2和CAT3在幼胚中表达，而在幼叶中只有CAT1和CAT3表达[13]。臭氧诱导玉米CAT1和CAT3表达而抑制CAT2表达，在外源ABA作用下，CAT1表达，CAT3不变，而CAT2则降低[14-15]，光诱导玉米CAT2在叶发育过程中的表达在翻译水平受到控制，黑暗抑制mRNA翻译多肽的延伸，从而抑制CAT2的表达[16]。赵亚男等的研究表明:层积处理可使铅笔柏种子内脂肪及蛋白质降解，氨基酸过氧化氢酶活性提高1倍，层积期间由于胞间联丝的恢复，增强膜的透性，氧化酶和水解酶活性增加，呼吸作用加强，产生了大量ATP并为种子萌发提供了原动力[17]。党海山等[18]的研究表明：在萌发初期（萌发前3d）GA3处理，可以显著地提高毛柄小勾儿茶种子中过氧化物酶的活性，从而促进休眠解除，提高了萌芽率。SOD、POD和CAT是膜脂过氧化防御系统的主要保护酶，它们保持较高的活性可以迅速清除积累的活性氧，避免细胞膜发生膜脂过氧化，使细胞得到保护，从而提高植物的抗逆性[19]。由前人的研究结果可知，在不同的组织、器官、发育时期及环境条件下，CAT基因表达具有精细的调控机制；而在人为解除植物组织休眠方面的研究结果表明，适宜的外界环境胁迫或物质诱导下，休眠组织的过氧化氢酶活性提高而提早解除休眠，但具体CAT1、CAT2和CAT3基因表达的精细调控有待进一步研究。另外张运涛等[20]的研究结果单氰胺是一种植物休眠终止剂，它可有效地抑制植物体内过氧化氢酶的活性，加速植物体内氧化磷酸戊糖（PPP）循环，从而加速植物体内基础性物质的生成，刺激作物生长，终止休眠。

本研究表明：经单氰氨诱导葡萄休眠芽体，能比对照提早12d左右萌芽[5]，单氰氨处理后与对照的葡萄芽体基因表达出现了变化，用cDNASRAP技术分离了一些差异表达的基因，对在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测中差异明显、重复性好、稳定性高的差异片段进行回收克隆，获得了一批差异表达的基因。经反向Northern鉴定，得到了6个阳性克隆，进行测序。用BLASTx在NCBI数据库中进行同源性比对，分析发现6个差异片段中Esc1表达的差异片段找到同源的基因序列并有相应的基因功能注释，有2个有未知基因功能的同源序列。获得的已知基因功能的Esc1与玉米CAT2基因的同源性为74%。这一结果表明：CAT2基因是与植物的抗逆性、生长、终止休眠等密切相关的因子，在单氰氨调控下差异表达。这与前人 Or[20]、Halaly[10]和 Redinbaughm[11]等的报道一致。但具体CAT2基因表达的精细调控有待进一步研究。此外其他未知基因功能的差异表达可能也参与了单氰氨诱导巨峰葡萄休眠芽萌发的生理效应，也可能与葡萄本身抵抗单氰氨作用的一系列防御应激反应相关。

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