雷米普利对舒张性心力衰竭大鼠心房肌L型钙通道的影响

郭作兵++++孙淑娟

[摘要] 目的 观察雷米普利对舒张性心力衰竭（DHF）大鼠模型心房肌细胞L型钙通道的影响。 方法 腹主动脉缩窄术建立DHF大鼠模型，随机分为DHF组及雷米普利大、中、小剂量组，另设对照组。全细胞膜片钳检测心房肌细胞L型钙通道电流（ICa-L）；RT-PCR检测L型钙通道上Cav1.2 mRNA的表达；Western blot检测钙调控相关蛋白LTCC的表达。 结果 与对照组比较，DHF组大鼠心房肌细胞ICa-L电流密度峰值、Cav1.2 mRNA表达及钙调蛋白LTCC的表达明显降低（P<0.05）；与DHF组比较，雷米普利组心房肌细胞ICa-L电流密度峰值明显增加、Cav1.2 mRNA及钙调控蛋白LTCC的表达增加（P<0.05），且剂量越大增加越明显。 结论 雷米普利能上调舒张性心力衰竭大鼠心房肌ICa-L电流密度峰值，增加Cav1.2 mRNA及钙调控蛋白LTCC的表达，对DHF大鼠有治疗作用，其机制与调控心房肌细胞L型钙通道的功能有关。

[关键词] 舒张性心力衰竭；L型钙通道；雷米普利；Cav1.2

[中图分类号] R972[文献标识码] A[文章编号] 1674-4721（2014）06（b）-0015-04

Influences of ramipril on L-type calcium channel in rats with diastolic heart failure

GUO Zuo-bing1,2 SUN Shu-juan1,3▲

1.School of Pharmaceutical Sciences,Shandong University,Jinan 250012,China;2.Department of Pharmacy,Central Hospital of Qilu Petrochemical Hospital Group,Zibo 255400,China;3.Department of Pharmacy,Shandong Qianfoshan Hospital,Jinan 250014,China

[Abstract] Objective To observe the influence of ramipril on L-type calcium channel in rats with diastolic heart failure (DHF). Methods The rat model of DHF was established by using abdominal aortic coarctation,and then the rats were randomly divided into DHF group,high-dose,mid-dose and low-dose ramipril groups and control group.L-type calcium channel current (ICa-L) was investigated by using a whole cell patchclamp technique.The expression levels of Cav1.2 mRNA were measured by RT-PCR analysis.The expression levels of LTCC were measured by Wsetern blot analysis. Results Compared with control group,the peak density of atrial ICa-L,the expression levels of Cav1.2 mRNA and the expression levels of LTCC was lower in DHF group (P<0.05).Compared with the DHF group,the peak density of atrial ICa-L,the expression levels of Cav1.2 mRNA and the expression levels ofLTCC increased in three ramipril groups (P<0.05).The more dose of ramipril,the more increasing in ramipril group. Conclusion Ramipril can improve the peak density of atrial ICa-L,the expression levels of Cav1.2 mRNA and the expression levels of LTCC,has the therapeutic effect on DHF in rats,and the mechanism may be related to improving the activties of L-type calcium channel.

[Key words] Diastolic heart failure;L-type calcium channel;Ramipril;Cav1.2

舒张性心力衰竭（diastolic heart failure，DHF）是一组以具有心力衰竭的症状和体征，射血分数正常而舒张功能异常为特征的临床综合征[1]。近年来，DHF的发病率增高，心房肌细胞L型钙通道功能的异常是其发生的主要原因之一。研究证实，DHF发生时常伴有心房颤动，心房颤动对心房肌细胞L型钙通道电流（ICa-L）有下调作用[2-3]。血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）在心房颤动一级预防和治疗中具有重要意义。本研究拟通过观察雷米普利对DHF大鼠心房肌细胞ICA-L电流密度峰值、与L型钙通道相关的Cav1.2 mRNA表达水平、L型钙通道相关的钙调控蛋白LTCC表达水平的影响，以探讨雷米普利对DHF大鼠L型钙通道的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SD大鼠，雄性，体重为200～250 g，许可证号：SYXK（鲁）2012-2010。

1.1.2 试剂与溶液

HEPES、EGTA和牛磺酸均购于Sigma公司，DHPRa1（LTCC）抗体购于Abcam公司，PVDF膜购自美国Millipore公司，其余的试剂均为国产的分析纯。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分组

选择SD雄性大鼠30只，腹主动脉缩窄法制造DHF大鼠模型。模型组大鼠以3%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉。固定，剃毛，消毒，开腹腔。暴露左肾上缘腹主动脉，分离腹主动脉，银夹造成腹主动脉部分狭窄，关闭腹腔。对照组仅游离腹主动脉但不缩窄，其他操作与手术组相同。术后8周，通过超声心动图及心导管等方法检测大鼠心脏舒张功能指标，确立造模成功[4]。将大鼠手术组随机分为DHF组，雷米普利大、中、小剂量组。大、中、小剂量组分别给雷米普利1.25、2.50、5.00 mg/（kg·d）灌胃，DHF组和对照组等量生理盐水灌胃，连续8周。

1.2.2 全细胞膜片钳记录ICa-L

胶原酶解法分离大鼠心房肌细胞[5-6]。取得适合细胞，放入显微镜的细胞池中，贴壁。玻璃电极灌入电极液，电极与细胞表面形成高电阻，完成封接破膜补偿快慢电容。MODE置向VC后进行ICa-L记录。

1.2.3 RT-PCR检测Cav1.2 mRNA的表达

1.2.3.1 提取RNA剪取大鼠心房组织，称取75 mg，放入Trizol匀浆，离心，取上清液，氯仿充分混匀，离心20 min，取上清液移，异丙醇沉淀，再离心弃上清，后将RNA用1 ml 75%乙醇洗涤，离心，除乙醇后加0.01%焦碳酸二乙酯，温浴15 min，后在A260/A280下定量RNA。

1.2.3.2 RT-PCR反应混合好RT反应及PCR反应体系，加水至10 μl混匀，置于PCR仪上，94℃变性5 min，后扩增30个循环，72℃延伸5 min。凝胶电泳，染色。

1.2.4 Western blot检测LTCC的表达

提取心房肌细胞膜蛋白，取大鼠左心房组织120 mg，剪碎。后加入裂解液和蛋白酶抑制剂。于匀浆器中打碎，后4℃，离心5 min。取上清液置于EP管，4℃离心。测定膜蛋白浓度。SDS-PAGE电泳分离蛋白，转移蛋白到PVDF膜上，过夜。脱脂牛奶封闭1 h，1抗孵育及漂洗，2抗孵育及漂洗，加入DAB显影液显色。

1.3 统计学方法

应用SPSS 17.0统计软件处理数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 雷米普利对DHF大鼠血流动力学的影响

与对照组比较，DHF组心率（HR）、左室内压上升下降最大速率（±dp/dt）及左室收缩压（LVSP）无显著变化（P>0.05），左室舒张末压（LVEDP）显著升高（P<0.05），左室松弛时间常数（T）显著延长（P<0.05）。与DHF组比较，雷米普利组HR、±dp/dt、LVSP无明显变化（P>0.05），LVEDP及T明显缩短（P<0.05），且中高剂量组较低剂量组变化更明显（P<0.05）（表1）。

表1 雷米普利对DHF大鼠血流动力学的影响（x±s）

与对照组比较，*P<0.05；与DHF组比较，#P<0.05；与低剂量组比较，△P<0.05

2.2 雷米普利对ICa-L的影响

与对照组比较，DHF组大鼠心房肌细胞ICa-L峰值电流密度明显降低（P<0.05）；与DHF组比较，雷米普利组心房肌细胞ICa-L峰值电流密度显著上升（P<0.05），且中、高剂量组较低剂量组上升更明显（P<0.05）（图1、表2）。

图1 雷米普利对ICa-L的影响

表2 雷米普利对ICa-L的影响（x±s）

与对照组比较，*P<0.05；与DHF组比较，#P<0.05；与低剂量组比较，△P<0.05

2.3 雷米普利对L型钙通道上Cav1.2 mRNA表达的影响

与对照组比较，DHF组大鼠心房肌细胞Cav1.2 mRNA表达水平明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）；与DHF组比较，雷米普利组大鼠心房肌细胞Cav1.2 mRNA表达显著增加，差异有统计学意义（P<0.05），且剂量越大增加越明显（图2）。

图2 雷米普利对L型钙通道上Cav1.2 mRNA表达的影响

2.4 雷米普利对钙调控蛋白LTCC表达的影响

与对照组比较，DHF组大鼠心房肌细胞蛋白表达水平较对照组明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）；与DHF组比较，雷米普利组大鼠蛋白表达水平明显上升，差异有统计学意义（P<0.05），且剂量越大上升越明显（图3）。

图3 雷米普利对钙调控蛋白LTCC表达的影响

3 讨论

心房肌细胞的L型钙通道在电压依赖性钙离子通道中占主导作用，是形成慢反应及兴奋功能的主要成分[9]。Bosch等[10-11]研究认为，DHF常伴有心房颤动的发生，心房肌细胞ICa-L出现下调现象。ICa-L的减少导致动作电位不应期（action potential duration，APD）缩短及APD对频率的适应性下降，导致心房颤动的发生并有利于心房颤动的维持。本研究结果显示，DHF组大鼠心房肌细胞ICa-L峰值电流密度下降，提示ICa-L峰值电流密度的下降，可能是L型钙通道功能改变，导致心房颤动持续发生，并且可能是DHF大鼠发生房性心律失常和电生理重构的离子基础。另本研究中，DHF大鼠的Cav1.2 mRNA及钙调蛋白LTCC的表达显著降低，提示ICa-L降低可能由基因水平和蛋白表白水平的改变所介导。

雷米普利是ACEI类经常使用的药物之一[12]。现在研究证实，ACEI可以通过抑制血管紧张素Ⅱ预防心律失常。在DHF中，肾素血管紧张素系统过度激活和血管紧张素Ⅱ增加，血管紧张素Ⅱ通过激活L型钙通道，增加摄取细胞外的Ca2+并促进肌浆网Ca2+释放，使心房肌钙超载加重[13-14]。雷米普利拮抗血管紧张素Ⅱ的作用是其调节DHF心肌ICa-L电重构的重要机制。不同剂量雷米普利灌胃处理后，能逆转DHF组大鼠心房肌细胞ICa-L下调，并上调Cav1.2 mRNA及钙调蛋白LTCC的表达。雷米普利抑制ICa-L的降低，使钙通道失活减慢，增加细胞外钙摄取和肌浆网钙释放，从而减轻细胞内钙超载，延长心房APD，抑制心房颤动的发生。

心房电重构分为真假两种电性重构，其中真性重构出现在心房颤动开始后的数小时或数天。真性重构中，离子通道蛋白基因表达改变，随之出现持续时间甚久的通道蛋白数量及功能变化[15-16]。本实验中，雷米普利上调了Cav1.2 mRNA及钙调蛋白LTCC的表达水平，显示雷米普利对L型钙通道的作用与基因水平和蛋白水平的改变都有关。因此，雷米普利通过对L型钙通道的影响，抑制心房肌细胞的真性电重构，对防治心房颤动有重要而持久的作用。

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（收稿日期：2014-03-05本文编辑：郭静娟）

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（收稿日期：2014-03-05本文编辑：郭静娟）