肌球蛋白轻链激酶对大鼠平滑肌细胞增殖的影响

李德来 邓为民 李宏钊

(天津医科大学基础医学院，天津 300070)

肌球蛋白轻链激酶(MLCK)高度表达于平滑肌细胞，是平滑肌细胞收缩调节的限速蛋白。在相应信号机制激动下，MLCK被磷酸化后激活肌球蛋白球部的ATP酶，触发ATP水解为肌细胞收缩提供能量，从而导致肌肉收缩。此外，MLCK还可以通过非激酶方式触发平滑肌收缩。有研究表明MLCK可对肿瘤细胞增殖调控起重要作用，近年研究又表明MLCK在慢性缺氧导致的肺血管平滑肌收缩中起重要作用〔1〕，但MLCK对平滑肌细胞增殖的影响目前尚不清楚。本研究旨在通过研究阐明MLCK在平滑肌细胞增殖中的作用及其可能涉及的机制。

1 材料和方法

1.1材料 新生SD大鼠(约4周龄)购自贵州大学实验动物中心。DMEM高糖培养基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶〔含0.5%乙二胺四乙酸(EDTA)〕及磷酸盐缓冲液(PBS)购自Gibico公司；8肽胆囊收缩素(CCK-8)细胞增殖检测试剂盒购自日本同仁化学研究所(Dojindo)；兔抗大鼠α-肌动蛋白单克隆抗体购自Abcam公司；真核表达及病毒包装所需元件购自Addgene，引物及shRNA片断由Invitrogen公司负责合成；RNA抽提试剂Trizol及PCR检测试剂均购自日本宝生物公司。

1.2肺动脉血管平滑肌细胞(VMSC)培养 处死大鼠后，以75%酒精擦拭大鼠以消毒，分离并取出肺动脉后将之置于无菌PBS内，冲净血液并去除结缔组织，最后将肺动脉剪成1 mm3左右大小组织块置于培养瓶内于37℃孵育2 h。取出培养瓶并加入含10% FBS及1%双抗的DMEM培养基，再次置于细胞培养箱内培养，每3～5天换液1次，直至细胞从组织块周围长出。最后用0.25%胰蛋白酶消化细胞，扩大培养。使用平滑肌α-肌动蛋白染色并鉴定其纯度。

1.3载体构建及病毒包装 为从基因水平上调控MLCK表达，本研究拟采用病毒介导MLCK过表达或shRNA干扰方法进行。使用高保真PCR酶扩增大鼠MLCK编码序列(CDS序列)全长，并于起始启动子前添加Kozak序列以增强其转录，将扩增产物经酶切后连接至慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1α-copGFP，最后使用psPAX2及pMD2.G包装慢病毒后转染VMSC，以PCR方法检测MLCK上调情况。全部引物见表1。将shRNA溶解并置20 ρmol于20 μl退火缓冲液(10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA及200 mmol/L NaCl)中，以PCR仪以1为单位进行梯度降温，每个温度维持1 min，最后取出产物即为退火完全的shRNA，经非变性聚丙稀酰胺凝胶(PAGE)琼脂糖电泳证实该方法可将shRNA彻底退火成双链。将上述退火后的shRNA与酶切后的miRZip载体连接，筛选出正确重组子后按上述方法包装慢病毒并转导VSMC。

1.4VSMC增殖检测 使用内皮素(ET)-1诱导VSMC增殖，以CCK-8细胞增殖试剂盒检测不同MLCK表达水平对VSMC增殖的影响，观察MLCK表达水平对VSMC增殖的影响。

1.5统计学分析 计量资料组间比较采用t检验。

表1 本研究中所使用PCR引物及shRNA序列

2 结 果

2.1慢毒包装及基因转导效果 本研究过程中已使全部VSMC带上外源基因(图1)。RT-qPCR结果及Western印迹结果亦显示MLCK被显著上调或抑制(图2)。

2.2MLCK水平改变对VSMC增殖和ETA-R的影响及Rho激酶在其中的作用 过表达MLCK可直接导致VSMC增殖能力增强，而且还进一步增殖被ET-1刺激的VSMC增殖；而抑制MLCK可减弱VSMC增殖能力并抑制ET-1导致的VSMC增殖。见图2。RT-qPCR(PVSMC-miRNA Zip组：0.83±0.21，PVSMC-shRNA组：0.27±0.03，P<0.05)及Western印迹(PVSMC-COPgfp组：0.78±0.17，PVSMC-MLCK组：15.08±2.65，P<0.05)结果均显示MLCK表达升高可导致VSMC ETA-R升高，ET-1刺激下可加剧这种改变；而下调MLCK表达可抑制ETA-R表达，并抑制ET-1带来的ETA-R表达水平增加。

2.3MLCK对ETA-R的作用与Rho激酶作用的关系 Rho激酶抑制剂Fasudil可减弱MLCK及ET-1升ETA-R的作用。ET-1、ET-1+MLCK、ET-1+shRNA、ET-1+MLCK+FASUDIL组OD值分别为0.71±0.14，0.89±0.16，0.34±0.04，0.58±0.07，见图3。

图1 PVSMC明场(A)和PVSMC-pCDH-MLCK-copGFP荧光(B)

A.免疫印迹显示MLCK被显著上调或下调；B.RT-qPCR结果与免疫印迹结果一致

图3 MLCK对PVSMC表达ETA-R增殖的作用

3 讨 论

本研究采用慢病毒操纵基因表达的方法，证实了MLCK在VSMC增殖中的作用。结果表明，MLCK表达升高可促进VSMC增殖及上调ETA-R表达水平，进一步研究还表明，MLCK的这种作用可能是通过其对Rho激酶的激活实现的。

肺动脉高压的重要发生机制之一是平滑肌收缩。MLCK在平滑肌收缩中的作用已有多量报道。经典理论认为，MLCK通过使用MLC磷酸化触发局部Mg2+-ATP酶活性，从而引发肌肉收缩〔2〕。在随后针对MLCK研究历程中，学者发现MLCK以非激酶方式调节平滑肌收缩〔3〕。但无论MLCK以何种方式进行调节及发挥作用，结果均一致认为随着MLCK增加，肌丝运动速度增强，平滑肌收缩增强。

在肺动脉高压中，除平滑肌收缩外，平滑肌增殖参与血管重塑及平滑肌对缩血管物质的反应也是决定肺动脉高压进展的重要因素〔4〕。然而，尽管MLCK在平滑肌收缩研究中已得到充分研究，其在平滑肌增殖中的作用至今尚未见报道。本研究结果发现MLCK可促进VSMC增殖并促进ETA-R表达。鉴于VSMC增殖及ET-1在肺动脉高压中的重要作用，本研究结果提供了MLCK调节肺动脉高压的机制，可能为肺动脉高压防治带来更多思路。

Rho激酶在肺动脉高压中的作用日益得到重视，大量研究认为Rho激酶激动剂对肺动脉高压有益，且目前已成为肺动脉高压干预靶点之一〔5〕，且MLCK与Rho在平滑肌收缩中的相互作用已被报道〔6〕。本研究结果显示，Rho激酶抑制剂至少可部分抵消MLCK的激活VSMC增殖及增强ETA-R表达作用。尽管其机制未明，但这提示Rho激酶这一已在肺动脉高压中得到证实的关键酶可能参与MLCK调节肺动脉高压的机制中。目前，尚无证据显示MLCK能调节Rho激酶活性；同时，鉴于MLCK及Rho激酶对平滑肌收缩作用的同向性，Rho激酶作为一放大效应分子而非MLCK直接调节目标的可能性仍不能排除，其具体机制仍有待进一步证实提供更多证据。

4 参考文献

1Jernigan NL，Walker BR，Resta TC.Reactive oxygen species mediate RhoA/Rho kinase-induced Ca2+sensitization in pulmonary vascular smooth muscle following chronic hypoxia〔J〕.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2008；295(3)：L515-29.

2Kirschstein T，Protzel C，Porath K，etal.Age-dependent contribution of Rho kinase in carbachol-induced contraction of human detrusor smooth muscle in vitro〔J〕.Acta Pharmacol Sin,2014;35(1):274-81.

3梁明丽，崔 颖，吕广艳，等.肌球蛋白轻链激酶非激酶活性调节磷酸化肌球蛋白ATP酶活性及肌丝运动〔J〕.生物化学与生物物理进展，2008；35(1)：91-6.

4Karoor V，Oka M，Walchak SJ，etal.Neprilysin regulates pulmonary artery smooth muscle cell phenotype through a platelet-derived growth factor receptor-dependent mechanism〔J〕.Hypertension，2013；61(4)：921-30.

5Mathew R.Pulmonary hypertension：current therapy and future prospects〔J〕.Cardiovasc Hematol Agents Med Chem，2011;9(3)：165-82.

6Kogata N，Tribe RM，Fassler R，etal.Integrin-linked kinase controls vascular wall formation by negatively regulating Rho/ROCK-mediated vascular smooth muscle cell contraction〔J〕.Genes Dev，2009；23(19)：2278-83.