血管内皮生长因子-D表达与非小细胞肺癌淋巴管生成和淋巴结转移的相关性

张 伟 任凤云 金 丹 潘艳明 胡 静 冯玉宽

(牡丹江医学院附属红旗医院呼吸内科，黑龙江 牡丹江 157011)

淋巴结转移程度决定了肺癌患者的预后和治疗手段的选择。近来，由于淋巴管的特异性标志物如淋巴管内皮透明质酸受体(LYVE)-1,相关基因prox-1,足细胞表面蛋白podoplanin和单克隆抗体D2-40等的发现，使研究肿瘤新生淋巴管的临床和病理学意义成为可能，也使肿瘤淋巴管生成和淋巴结转移逐渐成为研究热点。目前普遍认为，在一些肿瘤中血管内皮生长因子(VEGF)-C和VEGF-D调控着淋巴管的生成，二者可以激活其受体VEGFR-3而诱导肿瘤淋巴管生成和促进肿瘤淋巴道转移。然而，已往多集中于VEGF-C的研究，并且这些研究表明非小细胞肺癌(NSCLC)组织VEGF-C的表达与淋巴结转移呈正相关，抑制VEGF-C表达可明显降低淋巴管生成和淋巴结转移的发生。而有关VEGF-D在NSCLC的表达及其临床意义的报道较少。本文拟探讨NSCLC组织VEGF-D的表达及微淋巴管密度(LMVD)与包括淋巴结转移在内的病理学参数间的相关性。

1 材料与方法

1.1实验材料 选自2007年9月至2008 年6月哈尔滨医科大学附属第二医院和附属第三医院确诊为NSCLC患者的手术切除组织。其中腺癌58例，鳞状细胞癌38例。样本取自手术切除的肺叶组织，标本经4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,4 μm 厚连续切片,常规苏木素-伊红(HE) 染色，其中60例新鲜组织置于液氮中速冻，储存于-80℃低温冰箱中直至RNA抽提。兔抗人VEGF-D多克隆抗体和鼠抗人D2-40单克隆抗体购自Santa Cruz公司。PV-9000免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。实时定量(QRT)-PCR检测试剂均购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司。

1.2免疫组织化学染色和结果判定 免疫组织化学染色方法参照PV29000 两步法免疫组织化学试剂盒,二氨基联苯胺(DAB)显色,HE复染,中性树脂封片,光镜观察。磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。以细胞质和细胞膜呈现棕黄色颗粒为阳性，参照以往研究的判定标准,以每张切片中看到>30%的肿瘤细胞质染色阳性判定为VEGF-D阳性。参照Weidner的判定标准,在低倍镜下，选取D2-40阳性脉管最丰富的区域,然后在200 倍视野范围计算5个视野的淋巴管数目,取其平均值作为LMVD。

1.3RT-PCR

1.3.1总RNA 的提取及反转录反应 将肺癌组织从液氮中取出,研磨成粉末,转入焦炭酸二乙酯(DEPC)水处理过的1.5 ml微量离心管(EP)管中,按比例加入总RNA 提取液RNAiso reagent (TaKaRa Code.D312,大连)，按说明书提取肺癌组织总RNA ,-70℃保存待用。取适量稀释后测定A260 和A280 时的吸光度比值,计算RNA 的浓度。另取5 μl RNA 溶液用1.2%琼脂糖凝胶电泳,观察RNA 的完整性。取总RNA 1 μg ，以Oligo dT 和 Random 6 mers (TaKaRa,大连)为引物,使用PrimeScriptTM RT-PCR Kit (TaKaRa Code.DRR014A,大连)进行反转录反应,按说明进行反转录反应，反应产物-20℃保存待用。

1.3.2引物设计与合成 在GenBank上查找人VEGF-D基因的mRNA 序列,取其保守区,使用Primer Premier 5.0设计引物,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，引物由TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司合成。VEGF-D基因的引物序列为：正义5′-CCGTGAAAATGCTGAAAGAGG -3′，反义5′-GTTGCCGATGTGAATGAGGA-3′；GAPDH基因的引物序列为：正义5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，反义5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。 随机取两样本的cDNA作为模板,应用Thermal Cycler DiceTM Real time system(TaKaRa,大连)进行Real Time PCR扩增，分析扩增曲线和融解曲线，鉴定引物的特异性。

1.3.3标准曲线的制作 取样品总RNA(500 ng)进行反转录，以获得的cDNA为模板，应用Thermal Cycler DiceTM Real time system(TaKaRa,大连)进行Real Time PCR扩增，分析扩增曲线的Ct值，取目的基因表达量丰富的样品cDNA用EASY Dilution分别按8倍梯度稀释(80、81、82、83、84倍)，以作为管家基因(GAPDH)和目的基因(VEGF-D)的标准品，进行RT-PCR反应，分别制作管家基因和目的基因的标准曲线。RT反应体系为：5×PrimeScriptTM Buffer 2 μl,PrimeScriptTM RT Enzyme Mix 10.5 μl,Oligo dT Primer(50 μmol/L)0.5 μl ，Random 6 mers(100 μmol/L)0.5 μl， Total RNA 2 μl ，RNase Free dH2O 4.5 μl，反应条件为：37℃15 min 85℃5 s ；PCR反应体系为：SYBR Premix Ex Taq(2×) 12.5 μl ,正义、反义引物(10 μmol/L) 0.5 μl 、RT产物2 μl、dH2O 10～25 μl。反应条件为:95℃预变性10 s;95℃ 5 s ,60℃ 30 s，45个循环。

1.3.4VEGF-D mRNA荧光定量PCR检测 取各样本cDNA 与相应的引物按照以上条件混合,同上条件进行PCR 扩增,同时作标准曲线,将目的基因的CT值与标准曲线相比较计算目的基因的浓度。为消除RNA 降解的影响,以目的基因VEGF-D与内参照(GAPDH) 的比值表示目的基因的相对含量。每个样本重复3 次，以均值来表示结果。

2 结 果

2.1VEGF-D 免疫组织化学染色结果 免疫组化染色显示VEGF-D主要表达于癌细胞的胞质(图1A),在癌侵犯边缘的血管和淋巴管的内皮也可见VEGF-D的阳性表达(图1B),并且在癌的基质部分和成纤维细胞亦可见VEGF-D的阳性表达(图1C)。在96例NSCLC组织中,VEGF-D 在侵犯边缘的阳性率明显高于癌中央组织的表达,呈现染色不均一性(41.7% vs 24.0%,P=0.009)。

A B C

2.2VEGF-D 的表达与临床病理参数之间的关系 在癌侵犯边缘区， VEGF-D高表达组的淋巴结转移及淋巴管侵犯的发生明显高于低表达组(P=0.019,P=0.025)。然而在癌中央区却未发现这种相关性。见表1。

2.3VEGF-D mRNA在NSCLC组织的表达与临床病理资料的相关性 癌中心组织、癌侵犯边缘组织和癌周围肺组织表达量差异明显。癌中央组织VEGF-D基因的表达量明显低于癌周围肺组织(0.193±0.154 vs 3.542±1.513,P<0.001)，VEGF-D mRNA的表达量在癌侵犯边缘组织亦高于癌周肺组织 (4.309±2.075 vs 3.542±1.513,P=0.022)。

表1 NSCLC组织VEGF-D蛋白表达与临床病理参数的相关性〔n(%)〕

淋巴结转移组中央部位的VEGF-D mRNA表达低于非淋巴结转移组，而在边缘部位却又截然相反。对于边缘部位，VEGF-D mRNA的高表达与淋巴结转移或淋巴管侵犯具有相关性(P=0.007,P=0.033)。见表2。

2.4VEGF-D表达与LMVD的相关性 肿瘤组织中，癌边缘部位LMVD明显高于癌中央区(19.01±7.55 vs 15.15±5.72，P<0.001)，有淋巴管侵犯的肿瘤组癌边缘LMVD明显高于无淋巴结转移组(21.37±7.93 vs 17.48±6.27,P=0.009)，有淋巴结转移的肿瘤组癌边缘LMVD明显高于无淋巴结转移组(21.28±7.89 vs 17.81±6.90，P=0.024)。见图2。

把LMVD高于平均密度的肿瘤组定义为高淋巴管密度组，反之定义为低淋巴管密度组。在癌侵犯边缘区,高淋巴管密度的VEGF-D mRNA表达明显高于低淋巴管密度组(P=0.020)。而在癌中央区这种相关性未达到统计学意义(P=0.541)。

图2 淋巴管的免疫组化染色及淋巴管密度与淋巴管侵犯和淋巴结转移的关系

表2 NSCLC组织VEGF-D mRNA表达与临床病理参数的相关性

3 讨 论

肿瘤血管生成与肿瘤的血行转移密切相关。但大部分恶性肿瘤特别是上皮来源的恶性肿瘤早期以淋巴道转移为主，因此，区域引流淋巴结的转移情况是评估预后和制定治疗策略的重要生物学指标。目前认为除少数的恶性肿瘤(如肝癌、小细胞肺癌)之外，大多数肿瘤的淋巴道转移早于血道转移。

NSCLC在肿瘤早期即可发生淋巴结转移，因此局部淋巴结的转移程度是决定患者临床病理分期和临床治疗的重要因素之一。前期关于NSCLC巴管生成的研究多局限于VEGF-C和其受体(VEGFR-3)的研究。然而，以往的这些研究在有关VEGF-C是否影响NSCLC预后这一问题上始终未取得一致的结论〔1～5〕，因此VEGF-C表达与淋巴管生成和淋巴结转移的关系仍然备受关注〔6,7〕。VEGF-D是VEGF家族中的另一成员，研究〔8〕显示可以诱导鼠肿瘤模型淋巴管生成和促使肿瘤细胞经淋巴管转移。但是很少有文献报道VEGF-D在NSCLC中的表达意义，因此在NSCLC中的VEGF-D表达与淋巴管生成和淋巴结转移的关系人们知之甚少。

Arinaga〔3〕,Ogawa〔5〕和Renyi-Vamos〔1〕等应用免疫组织化学染色方法报道VEGF-C表达与NSCLC淋巴结转移的发生没有明显的相关性，而Kajita等〔2〕表达二者明显相关。Niki〔4〕和Maekawa等〔9〕报道在肺腺癌VEGF-D的低表达与淋巴结转移的发生明显的相关。许多学者〔10〕认为，上述结论不一致性主要是由于研究方法不同或是肿瘤之间VEGF-D的表达不均一。提示VEGF-D的表达可能是调控淋巴管生成的重要因子。Yokoyama等〔11〕报道VEGF-D通过与其在淋巴管和血管表达的特异受体结合建立的旁分泌途径，调控肿瘤的淋巴管和血管生成。本研究结果提示，免疫组化和PCR研究结果是否一致很可能取决于所检测部位，虽然通过QRT-PCR检测，显示VEGF-D mRNA表达水平不仅仅来源于肿瘤细胞，还有间质细胞等阳性部位，但是癌侵犯边缘VEGF-D mRNA同时高表达，而且与淋巴结转移和淋巴管侵犯的相关性提示，VEGF-D的高表达有利于肿瘤淋巴管生成和肿瘤细胞经淋巴管道转移，同时提示对VEGF家族整体的研究也许比在实验条件下单独研究其中某一因子更为重要。

有研究〔5〕显示肿瘤侵犯边缘的高LWVD有可能决定着肿瘤细胞的淋巴转移。虽然有一些关于NSCLC淋巴管生成的临床材料研究〔3,4，12〕，但还没有有关肿瘤边缘LMVD与VEGF-D mRNA表达的相关性研究。

综上，在NSCLC组织中VEGF-D的表达可能调控着肿瘤的淋巴管生成，癌侵犯边缘VEGF-D的高表达可能与淋巴管的生成和肿瘤细胞发生淋巴管侵犯和淋巴结转移密切相关。本研究也说明，VEGF-D 在NSCLC组织不同部位的表达有明显的差异，对癌组织的不同部位选择VEGF-D表达，会更加有利于评估患者的淋巴管生成和淋巴结转移的发生情况。

4 参考文献

1Renyi-Vamos F,Tovari J,Fillinger J,etal. Lymphangiogenesis correlates with lymph node metastasis,prognosis,and angiogenic phenotype in human non-small cell lung cancer〔J〕.Clin Cancer Res,2005;11(20):7344-53.

2Kajita T,Ohta Y,Kimura K,etal.The expression of vascular endothelial growth factor C and its receptors in non-small cell lung cancer〔J〕. Br J Cancer,2001;85(2):255-60.

3Arinaga M,Noguchi T,Takeno S,etal.Clinical significance of vascular endothelial growth factor C and vascular endothelial growth factor receptor 3 in patients with nonsmall cell lung carcinoma〔J〕.Cancer,2003;97(2):457-64.

4Niki T,Iba S,Tokunou M,etal.Expression of vascular endothelial growth factors A,B,C,and D and their relationships to lymph node status in lung adenocarcinoma〔J〕.Clin Cancer Res,2000;6(6):2431-9.

5Ogawa E,Takenaka K,Yanagihara K,etal.Clinical significance of VEGF-C status in tumour cells and stromal macrophages in non-small cell lung cancer patients〔J〕.Br J Cancer,2004;91(3):498-503.

6Takizawa H,Kondo K,Fujino H,etal.The balance of VEGF-C and VEGFR-3 mRNA is a predictor of lymph node metastasis in non-small cell lung cancer〔J〕. Br J Cancer,2006;95 (1):75-9.

7Kadota K,Huang CL,Liu D,etal.The clinical significance of lymphangiogenesis and angiogenesis in non-small cell lung cancer patients〔J〕.Eur J Cancer, 2008;44(7):1057-67.

8Stacker SA,Caesar C,Baldwin ME,etal. VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics〔J〕.Nat Med,2001;7(2):186-91.

9Maekawa S,Iwasaki A,Shirakusa T,etal.Correlation between lymph node metastasis and the expression of VEGF-C,VEGF-D and VEGFR-3 in T1 lung adenocarcinoma〔J〕.Anticancer Res,2007;27(6A):3735-41.

10Nakashima T,Kondoh S,Kitoh H,etal.Vascular endothelial growth factor-C expression in human gallbladder cancer and its relationship to lymph node metastasis〔J〕.Int J Mol Med,2003;11(1):33-9.

11Yokoyama Y,Charnock-Jones DS,Licence D,etal. Vascular endothelial growth factor-D is an independent prognostic factor in epithelial ovarian carcinoma〔J〕.Br J Cancer,2003;88(2):237-44.

12Adachi Y,Nakamura H,Kitamura Y,etal.Lymphatic vessel density in pulmonary adenocarcinoma immunohistochemically evaluated with anti-podoplanin or anti-D2-40 antibody is correlated with lymphatic invasion or lymph node metastases〔J〕.Pathol Int,2007;57(4):171-7.