电针对帕金森病大鼠的治疗作用及对基底节输出核团活性的影响

张雪梅 杨 芳 邢国庆

(泰山医学院机能学实验室，山东 泰安 271000)

针灸能改善帕金森病(PD)患者的症状，提高其生活质量〔1〕；但由于临床针灸研究工作的局限性，无法进行系统、准确的观察和分析，影响了对针灸治疗PD的疗效评价，同时也缺乏对针灸治疗PD机制的深入研究。在针灸治疗PD动物模型的研究报道中已经揭示〔2～4〕，高频电针刺激能有效改善PD模型动物的异常行为，并能保护多巴胺(DA)能神经元，抑制炎症反应和氧化应激反应，增加神经营养因子等的作用。PD运动症状的产生与基底神经节环路关系密切，因此调整基底神经节环路的功能可能是揭示针灸改善PD运动症状的机制所在。本实验拟在线刀切断内侧前脑束(MFB)的模型大鼠上，通过检测电针对纹状体内的酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学的变化来证实电针的治疗作用，分别在苍白球和腹侧中脑部位检测谷氨酸脱羧酶(GAD)67蛋白水平的改变，来探究电针是否通过对基底节输出核团γ-氨基丁酸(GABA)能神经元活性的调控而发挥治疗效应，以深入了解电针治疗的可能作用机制。

1 材料和方法

1.1材料 实验用Wistar雄性大鼠24只，体重200～250 g，由山东省中医药大学动物中心提供〔合格证号:SCXK(鲁)20050015-0001684〕。每笼4只群养，12 h/12 h昼夜循环照明，自由饮水和进食。主要药品和仪器如下：阿扑吗啡(APO,Sigma公司)，小鼠单克隆抗TH抗体(Sigma公司)，GAD67抗体：小鼠抗GAD67单克隆抗体(CHEMICON公司)；大鼠脑立体定位仪、可伸缩线刀(美国KOPF公司)，大鼠旋转行为记录仪(美国Columbus Instruments)。

1.2模型制备与处理 机械损伤MFB建立单侧PD模型〔5〕。动物用水合氯醛(350 mg/kg，i.p.)麻醉后，固定于大鼠脑立体定位仪上。Scoutern 线刀在立体定位仪的引导下，切断MFB，定位坐标为：前囟后3.5 mm，矢状线右侧旁开2.5 mm，硬膜下7.5 mm，得到单侧损伤的PD大鼠模型。动物随机分为假手术组、模型组和电针治疗组，每组大鼠数量在8只以上。术后第2天开始电针治疗，选取百会和大椎穴位，用HANS电针仪，施加逐级增强的电流强度，1、2和3 mA各持续10 min，共计30 min，1次/d，连续6 d为1个疗程，第7天进行行为学检测，共治疗4个疗程。

1.3检测指标 异常旋转行为的检测是将大鼠穿上束缚套后置于测试仪中，皮下注射APO(0.5 mg/kg)后记录大鼠诱发出现的旋转行为，计算大鼠在单位时间内的净旋转次数。黑质网状部的神经元主要是支配丘脑的GABA能投射神经元，检测中脑部位的GAD67的表达，能反映中脑部位尤其是黑质网状部GABA能神经元的活性。对各组大鼠在电针治疗28 d后，取腹侧中脑部位组织，用Western印迹检测中脑GAD67表达的变化。Western印迹检测中脑GAD67含量，一抗为鼠抗GAD67抗体(1∶500)，并加入用于作为内参的小鼠抗β-actin抗体，4℃孵育过夜。羊抗小鼠二抗(1∶3 000)孵育2 h后PBS洗去膜，成像系统进行扫膜。组化染色方法检测TH及GAD67形态改变，对大鼠灌流固定取全脑，冰冻切片厚度30 μm，分别进行染色后拍照。

2 结 果

2.1电针对PD模型大鼠异常旋转行为的影响 模型组大鼠在术后第1周起就能产生由(APO)诱发的向未损伤侧(左侧)的异常旋转行为，并呈进行性加重趋势；在第4周起，模型组大鼠的异常旋转行为与假手术组相比明显增多，而电针治疗可以明显降低PD大鼠的异常旋转行为。

2.2电针对PD模型大鼠纹状体内TH免疫反应阳性纤维的影响 PD大鼠在损伤侧纹状体内TH阳性纤维丢失比较明显，其损伤侧/未损伤侧的TH阳性纤维比值只有假手术组的34.7%(P<0.01)，电针治疗组的TH阳性纤维的光密度值明显增加，相对于模型组的纤维光密度值增加了45%(P<0.01)，表明电针治疗能减缓MFB损伤侧的TH阳性纤维的丢失，具有一定的神经保护效应。见图1。

2.3电针对GAD67蛋白在腹侧中脑表达的影响 MFB损伤侧中脑部位的GAD67表达含量显著增加，与假手术组相比较显著增加(P<0.01)。电针治疗能降低中脑部位的GAD67的过表达，与模型组相比较有显著增加(P<0.05)，提示电针治疗能降低中脑部位的GAD67的表达增多，电针降低了黑质网状部的GABA能神经元的活性。见图2。

图1 各组大鼠纹状体内TH免疫组化表达(DAB,×40)

图2 Western印迹检测中脑GAD67表达

2.4电针对苍白球内GAD67阳性神经纤维分布的影响 模型组损伤侧苍白球内的GAD67阳性纤维染色出现增强，电针治疗对这种增强没有明显影响；定量分析，模型组比假手术组的光密度值高出38%(P<0.05)；而电针治疗组与模型组的光密度值相比没有明显区别(P>0.05)。见图3。

图3 各组大鼠脑苍白球内GAD67免疫组化表达(DAB，×40)

3 讨 论

PD是中枢神经系统的一种神经退行性疾病，其病理变化主要是中脑黑质致密部(SNc)DA能神经元出现渐进性丢失，导致静止性震颤、肌肉僵直、运动迟缓等为特征的临床症状。

有研究表明〔3〕，电针治疗能明显缓解机械损伤MFB的PD模型中黑质部位DA能神经元的变性，可能是电针通过增加脑内营养因子的表达，而对DA神经元产生营养而具有保护作用。本研究结果提示，电针也能够缓解PD的异常旋转行为，同时对来自于黑质部位的DA能神经元投射到纹状体内的TH阳性神经纤维也具有一定的神经保护作用。本研究结果与以前的研究类似，均证实了电针的治疗效应。

基底神经节属于皮层下的结构，与运动功能、学习和记忆等功能都有关联〔6〕。在基底节中，纹状体接受来自皮层和丘脑的谷氨酸能(GLU)的传入，再通过两条通路发出GABA能投射到基底节的主要输出核团(SNr)和苍白球内侧核(GPi)，输出核团再调节丘脑的活性实现对运动的调控。基于这样的结构组成，SNr神经元的活性应该主要是受到GABA 和GLU 相互平衡的调节控制。然而，Windels等〔7〕用电生理和微电泳的实验证实，调节SNr神经元活性的主要因素是GABA能的传入，而不是GLU和GABA相互对抗作用的结果。这一假说进一步被实验验证，即向SNr内移植可释放GABA的工程细胞，显著减少PD大鼠模型的下颌震颤，其改善症状的原因就是GABA通过对SNr的神经元活性进行调节而发挥作用〔8〕。SNr神经元接受来自纹状体、苍白球及SNr内相邻细胞轴突的GABA能传入，这些GABA传入的作用就是抑制了SNr神经元的活性。以上均提示本实验需要进一步关注GABA等神经递质对PD运动症状的调节效应及其对DA能神经元的影响。

在PD状态下，由于纹状体DA的减少，经过基底节环路传导的结果之一就是基底节输出核团的神经元过度活跃〔9〕。因此，药物、手术损毁或电刺激等对PD患者的治疗，可能都是通过影响SNr或GP神经元的活性来发挥疗效的。本实验结果揭示出电针能抑制基底节输出核团SNr神经元在损伤时的过度活跃，从而增加丘脑的兴奋性，得以改善PD症状。

有实验也证实〔10〕，在PD动物模型中苍白球GABA的释放增加，或苍白球投射到SNr和EP的神经元表达的GAD67 mRNA也都有增加，及苍白球神经元的放电增加。这些结果提示苍白球的功能比较复杂，并不单纯是由纹状体苍白球通路的过渡活跃所致苍白球神经元的活性降低。此外，苍白球也受到底丘脑核的GLU兴奋性投射增加其活性，以及纹状体苍白球通路末梢的ENK也可以产生突触前抑制作用，减少了纹状体苍白球通路末梢GABA的释放〔11〕。本实验未能检测到电针对苍白球内GAD67染色的改变，可能是多种因素的相互干预。

本实验结果初步提示电针可产生行为改善效应，并且这种作用可能是通过抑制了基底节输出核团神经元的活性而实现的，而进一步的工作尚需充分验证。

4 参考文献

1Cristian A,Katz M,Cutrone E,etal.Evaluation of acupuncture in the treatment of Parkinson's disease:a double-blind pilot study〔J〕.Mov Disord，2005；20(9):1185-8.

2Liang XB,Liu XY,Li FQ,etal.Long-term high-frequency electro-acupuncture stimulation prevents neuronal degeneration and up-regulates BDNF mRNA in the substantia nigra and ventral tegmental area following medial forebrain bundle axotomy〔J〕.Brain Res Mol Brain Res，2002；108(1-2):51-9.

3Liang XB,Luo Y,Liu XY,etal.Electro-acupuncture improves behavior and upregulates GDNF mRNA in MFB transected rats〔J〕.Neuroreport，2003；14(8):1177-81.

4Liu XY,Zhou HF,Pan YL,etal.Electro-acupuncture stimulation protects dopaminergic neurons from inflammation-mediated damage in medial forebrain bundle-transected rats〔J〕.Exp Neurol，2004；189(1):189-96.

5Knusel B,Beck KD,Winslow JW,etal.Brain-derived neurotrophic factor administration protects basal forebrain cholinergic but not nigral dopaminergic neurons from degenerative changes after axotomy in the adult rat brain〔J〕.J Neurosci，1992；12(11):4391-402.

6Alexander GE，Crutcher MD.Functional architecture of basal ganglia circuits:neural substrates of parallel processing〔J〕.Trends Neurosci，1990；13(7):266-71.

7Windels F，Kiyatkin EA.GABA,not glutamate,controls the activity of substantia nigra reticulata neurons in awake,unrestrained rats〔J〕.J Neurosci，2004；24(30):6751-4.

8Carlson BB,Behrstock S,Tobin AJ,etal.Brain implantations of engineered GABA-releasing cells suppress tremor in an animal model of Parkinsonism〔J〕.Neuroscience，2003；119(4):927-32.

9Wichmann T,Bergman H,Starr PA,etal.Comparison of MPTP-induced changes in spontaneous neuronal discharge in the internal pallidal segment and in the substantia nigra pars reticulata in primates〔J〕.Exp Brain Res，1999；125(4):397-409.

10Chesselet MF，Delfs JM.Basal ganglia and movement disorders:an update〔J〕.Trends Neurosci，1996；19(10):417-22.

11Stanford IM，Cooper AJ.Presynaptic mu and delta opioid receptor modulation of GABAA IPSCs in the rat globus pallidus in vitro〔J〕.J Neurosci，1999；19(12):4796-803.