LOX基因对人绒癌Bewo细胞侵袭转移的影响及意义

王 璟 郭 影 赵向寨 李 萍

(河北医科大学第三医院，河北 石家庄 050051)

妊娠滋养细胞肿瘤(GTN)包括侵蚀性葡萄胎、绒毛膜癌、胎盘部位滋养细胞肿瘤，是来源于异常滋养细胞的肿瘤，多发于生育期妇女〔1〕。赖氨酰氧化酶(LOX)主要调节细胞外基质，包括5个成员，其中LOX定位于5q23.3～31.2，是肿瘤发生侵袭、转移的密切相关基因〔2，3〕。本研究采用RNA干扰技术，靶向构建LOX小干扰RNA(siRNA)，转染人绒癌Bewo细胞，敲低LOX基因表达，探讨对人绒癌Bewo细胞的影响。

1 材料与方法

1.1材料 人绒癌Bewo购于中国科学院上海细胞库，DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自GIBCO公司；LOX siRNA、Control siRNA-A、siRNA转染试剂购自Santa Cruz公司；LOX、N-cadherin,基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-7抗体均购自Santa Cruz公司。

1.2细胞培养 人绒癌Bewo细胞株由中国科学院上海细胞库提供，细胞经10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素DMEM培养基培养，37℃、5%CO2饱和度和湿度恒温培养箱中孵育。0.25%胰蛋白酶消化细胞传代，取对数生长期细胞。胰酶消化细胞计数，稀释细胞，使细胞密度为4×105个/ml，铺于无菌6孔培养板中，培养12 h至人绒癌Bewo细胞融合率达50%，弃去原细胞培养液，换无血清、无抗生素DMEM培养液，按转染试剂盒说明书要求用Transfection regent稀释LOX siRNA、Control siRNA及转染试剂Transfection medium/regent。实验分组：正常培养人绒癌Bewo细胞组(对照组，Control)、转染LOX siRNA细胞组(Mock)、转染Control siRNA细胞组(siRNA)。转染试剂作用6 h，无血清培养基冲洗细胞，换含10%血清、抗生素培养基继续培养。于转染24 h后，分别搜集细胞提取总RNA及总蛋白待测。

1.3实时定量PCR检测各蛋白 mRNA水平表达 转染后24 h，提取总RNA，测定A260/A280值介于1.8～2.0。以β-actin作为内参，总RNA 浓度为1 mg/ml进行逆转录，将cDNA为模版进行PCR反应，PCR反应条件：预变性95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，目的基因30个循环，内参循环数设定为25个循环。扩增完毕，溶解曲线进行分析，以β-actin为内参，利用CT值计算各组LOX mRNA相对值。用2-△△CT表示。各目的基因引物序列LOX：5′-TTACTCTCCATGGTGGTGCC-3′,5′-AGCTTCTTCTGCTTGTTGCC-3′；N-cadherin：5′-CAACTTGCCAGAAAA-CTCCAGG-3′,5′-ATGAAACCGGGCTATCTGCTC-3′；MMP-2：5′- CTATTCTGCCAGCACTTTGG -3′,5′- CAGACTTTGGTTCTCCAA-CTT -3′；MMP-7：5′-TGGGAACAGGCTCAGGACTATCT-3′,5′-TTCGGGTCTACACCTCACGG-3′；GAPDH ：正义5′-GTACGTCG-TGGAGTCCACTG-3′,反义5′-TCCACCACCCTG TTGCTGTA-3′。

1.4Western印迹法检测各目的基因蛋白水平表达 经过 24 h转染后，分别提取各组细胞，给予预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，于冰上进行操作，细胞裂解液裂解细胞，提取蛋白，二喹林甲酸(BCA)法蛋白定量，各组取等量细胞总蛋白于12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白，半干法转至NC膜，含5%脱脂奶粉TBS室温封闭1 h， LOX(兔抗1∶500，SANTA CRUZ)N-cadherin(兔抗1∶250，SANTA CRUZ)、MMP-2(鼠抗1∶500，SANTA CRUZ)、MMP-7(鼠抗1∶300，SANTA CRUZ)和GAPDH(兔抗1∶2 000，Abcam)，4℃过夜；二抗(羊抗鼠或羊抗兔1∶2 000)37℃ 1.5 h；增强化学发光法(ECL)显色 ，凝胶成像系统扫描分析。

1.5Transwell实验 将给予siRNA处理后细胞含血清100 ml/L的DMEM培养基悬浮，以2×105接种于Fibronectin包被的Transwell孔板其中的12个Transwell上，上室加入100 μl/孔，下室加入600 μl含血清200 ml/L的DMEM培养基。 经过24 h后，取出上室，用棉签蘸去上层的细胞，加入100 ml/L新鲜配置的甲醛溶液固定30 min，然后用SyTOXGreen染色15 min。甘油封片后用荧光显微镜检测细胞通过情况。平均每小时计数5个视野，取平均值分析细胞的穿透能力。

2 结 果

2.1LOX siRNA 转染后目的基因在蛋白及mRNA水平的表达 转染LOX siRNA 24 h后LOX 表达明显降低，约为对照组的(36±1.3)%，在mRNA水平明显降低约为对照组的(41±2.1)% ，见图1。

图1 各组目的基因蛋白表达情况

2.2LOX siRNA转染后细胞N-cadherin、MMP-2、MMP-7蛋白及mRNA水平表达 转染LOX siRNA 24 h后N-cadherin、MMP-2、MMP-7 表达明显降低，分别约为对照组的(35±2.6)%，(29±0.8)%，(42±1.7)%。在mRNA水平表达明显降低，结果以2-△△CT表示，分别为 0.34±0.213，0.30±0.064，0.45±0.301。见图2。

A:蛋白表达;B:mRNA表达

2.3Transwell检测细胞迁移能力的改变 转染后24 h，siRNA组穿膜细胞为(41±5)个，Mock组和Control组分别为(154±6)和(167±5)个，与Mock组和Control组比较，siRNA组穿膜细胞数明显减少(P<0.05)。而Mock组和Control组穿膜细胞数比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3 Transwell检测细胞迁移能力

3 讨 论

LOX在多种肿瘤中高表达，其中乳腺癌的研究中发现LOX过表达可以改变肿瘤细胞外基质的结构，激活特定通路，上调MMPs类的表达，从而降解基底膜，使得内皮细胞侵袭、迁移，出现新生血管，加速乳腺癌转移侵袭〔4〕。细胞外基质胶原和弹力蛋白聚合最初阶段的关键酶及细胞外基质形成修复关键因子均是LOX〔5,6〕，同时研究〔7〕发现干扰LOX可以有效抑制肿瘤细胞侵袭、转移。人绒毛膜癌临床特点具有转移早、侵袭性强，但机制不明，本研究说明MMPs与肿瘤侵袭、转移关系密切，侵袭转移主要通过降解细胞外基质〔8,9〕。

综上，沉默LOX在人绒癌Bewo中的表达，可明显降低人绒癌Bewo细胞侵袭、转移能力，为人绒毛膜癌基因治疗提供实验基础。

4 参考文献

1谢 幸,苟文丽.妇产科学〔M〕.第8版.北京:人民卫生出版社,2013：33-460.

2Abourbin DA, Di Cesare S, Orellana ME,etal. Lysyl oxidase expression and inhibition in uveal melanoma〔J〕. Melanoma Res, 2010;20(2):97-106.

3Wilgus ML, Borczuk AC, Stoopler M,etal. Lysyl oxidase: a lung adenocarcinoma biomarker of invasion and survical〔J〕. Cancer, 2011;117(10):2186-91.

4Pytliak M, Vargová V, Mechirová V,etal. Matrix metalloproteinases and their role in oncogenesis:a review〔J〕.Onkologie,2012;35(1-2):49-53.

5蒋 奕,杨华伟,唐 玮,等.乳腺癌组织LOX和HIF-1 表达及其临床意义的探讨〔J〕.中华肿瘤防治杂志,2011;18(7):517-9.

6张艳君,蒋稼欢,谢 静,等.赖氨酰氧化酶与人类疾病〔J〕.生物化学与生物物理进展,2011;38(5):389-99.

7李景涛,刘剑仑,韦 薇,等.干扰LOX表达对MDA-MB-231细胞侵袭迁移影响及其机制的探讨〔J〕.中华肿瘤防治杂志,2012;19(13):970-4.

8Roomi MW, Monterrey JC, Kalinovsky T,etal. Inhibition of invasion and MMPs by a nutrient mixture in human cancer cell lines: a correlation study〔J〕. Exp Oncol,2010;32(4):243-8.

9Hassan ZK, Daghestani MH. Cureumin effect on MMPs and TIMPs genes in a breast cancer cell line〔J〕. Asian Pac J Cancer Prev,2012;13(7):3259-64.