益气养阴消牴通络中药对早期糖尿病大鼠肾组织Podocin基因表达的影响

张江华 陈志强 赵雯红 孙玉凤 王月华 李黎莉 王凤丽 杨增芯

(河北医科大学中西医结合研究所，河北 石家庄 050017)

糖尿病肾病 (DN)是糖尿病(DM)全身微血管并发症之一。在DM中的发病率高达47.66%，是造成慢性肾衰竭的常见病因，占DM患者死亡率的60%，且发病率呈逐年上升趋势〔1〕。迄今为止，尚无有效的方法能够防止其发生和恶化。课题组针对DN的病因病机，提出了益气养阴、消牴通络治疗大法，临床取得了较好疗效，显示了较好的肾脏保护作用〔2～5〕，本研究进一步探讨其防治DN的作用机制。

1 资料与方法

1.1材料 健康雄性SD大鼠， 110只， SPF级，体重为(250±20)g，动物一般状态良好，由河北医科大学实验动物中心提供。动物合格证编号：905042。益气养阴、消牴通络中药(由黄芪、积雪草、丹参、茯苓、熟地、地龙、水蛭、鳖甲、大黄、砂仁等组成)，由河北医科大学附属河北省中医院中药房提供。符合国家药典标准(2000年版)，中药汤剂由本实验室制备，浓缩至含生药1 g/ml，分装灭菌， 4℃保存备用。厄贝沙坦片(安博维)，150 mg/片，杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药有限公司生产，批号0809155。链脲佐菌素(STZ)购自Sigma公司。反转录cDNA试剂盒、Taq酶、dNTP(Fermentas公司)。大鼠Podocin引物(上海捷瑞生物工程有限公司)。代谢笼(苏州工业园唯亭姑秀动物实验设备厂)；OneTouchUltraⅡ稳豪型血糖仪(美国强生公司)；全自动生化分析仪(美国贝克曼公司)；电子天平(德国赛多利电子天平有限公司)；PCR仪(英国ThorhnoHybaid公司)；三洋低温冰箱(日本三洋电机株式会社)；电脑三恒电泳仪(北京六一仪器厂)；电子显微镜(德国LEICA公司)。

1.2方法

1.2.1动物模型制备 大鼠适应性饲养1 w后，分别测定尿蛋白阴性后腹腔注射1%戊巴比妥钠进行麻醉，常规备皮消毒，经背部切口行左肾切除术，并于伤口处滴0.01 ml庆大霉素以预防感染。2 w后除肾切组外，剩余大鼠腹腔注射STZ(40 mg/kg)，将其溶于0.1 mol/L，pH 4.4的枸橼酸缓冲液中)， 72 h后尾静脉取血，血糖大于16.7 mmol/L为造模成功〔6〕。

1.2.2动物分组及给药方法 随机抽取10大鼠只为单纯肾切组，其余100只制备模型。造模期间有8只大鼠死亡，4只大鼠血糖偏低，从实验中剔除。造模成功的88只随机分为5组：模型组24只、厄贝沙坦组16只、中药低剂量组16只、中药中剂量组16只、中药高剂量组16只。厄贝沙坦组大鼠给予厄贝沙坦15 mg·kg-1·d-1灌胃，中药低、中、高剂量组大鼠分别给予中药5.29、10.58、21.16 g·kg-1·d-1灌胃，余组给予等剂量生理盐水灌胃药物剂量换算按体表面积换算〔7〕，每日灌胃1次。动物自由进食、饮水，室温18℃～20℃，相对湿度40%～70%，12 h交替照明，共给药6 w。实验期间每天测量1次尾静脉血糖，对血糖≥26.0 mmol/L可能危及生存的大鼠皮下注射适量长效胰岛素(0.5～4 U)，使血糖维持在16.7 mmol/L以上，并避免酮症，减少死亡。

1.2.324 h UPro及肾功能检测 于第6周末用代谢笼留取24 h尿液，记录总量，双缩脲法检测各组大鼠24 h尿蛋白(UPro)量。实验结束时，所用动物于空腹状态称体质量，3%戊巴比妥钠麻醉，股动脉取血，全自动生化分析仪(美国贝克曼公司)检测血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平；分离肾脏，用冰生理盐水冲洗，吸干水分，称肾质量，计算肾脏肥大指数(肾质量/体质量)。肾皮质液氮速冻后存放于-70℃冰箱，用于RT-PCR检测。

1.2.4RT-PCR检测肾皮质Podocin的表达 采用Trizol法提取肾皮质总RNA，反转录试剂盒反转录cDNA。Podocin上游引物：5′-AGCGAATCAGCACCTACGGACTTC-3′，下游引物：5′- GGTTCCACTCCACCAGCCTTCTTC-3′，扩增产物大小为200 bp； 内参照为GAPDH：上游引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，下游引物：5′-ACCACAGTCCATGCCA-TCAC-3′，扩增产物大小为452 bp。PCR反应条件： 95℃ 5 min；94℃ 30 s；退火温度分别为57.8℃、62.9℃ 30 s，72℃30 s；扩增30个循环，最后72℃ 7 min。取PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳。应用凝胶图像分析系统测定灰度值，以GAPDH基因表达量为内参照，以目的产物与GAPDH的灰度比值表示mRNA相对含量。

2 结 果

2.1一般情况 肾切组大鼠精神良好，饮食正常，反应灵敏，皮毛光泽，肌肉丰满，粪便呈麦粒状，尿量正常。其余组注射STZ后，均出现明显的多饮、多食、多尿症状，并逐渐出现精神萎靡，反应迟钝，少动抱团，部分大鼠出现全身感染、溃疡等并发症。其中12只大鼠血糖未达标准，剔除。上述症状以模型组最为显著。治疗期间造模各组均有大鼠死亡情况，其中中药低剂量组死亡3只，中药高、中剂量、厄贝沙坦组各死亡4只，模型组死亡10只，死亡原因估计为高血糖引起的代谢紊乱最终导致脏器衰竭。

2.2各组大鼠24 hUPro的比较 与单纯肾切组〔(8.05±1.20)mg/24 h〕比较，模型组、各治疗组UPro升高(P<0.05)；与模型组〔(54.75±11.16)mg/24 h〕比较，厄贝沙坦、中药低、中剂量组UPro下降〔(24.33±8.43)mg/24 h、(26.71±7.36)mg/24 h、(33.36±5.32)mg/24 h，P<0.05〕，中药高剂量组UPro无统计学意义〔(64.12±3.18)mg/24 h，P>0.05〕，厄贝沙坦、中药低、中剂量组之间比较无统计学意义(P>0.05)，说明厄贝沙坦、中药低、中剂量可显著降低糖尿病大鼠24 h UPro，且三组之间无明显差别。

2.3各组大鼠肾功能的比较 与单纯肾切组比较，模型组Scr、BUN值升高(P<0.01)，各治疗组Scr值无统计学意义(P>0.05)，BUN值升高(P<0.01)；与模型组比较，各治疗组Scr值下降(P<0.05)，中药低、高剂量组BUN值下降(P<0.05)，余组BUN值无统计学意义(P>0.05)，说明厄贝沙坦和各剂量中药对DN大鼠的肾功能损害均有明显的改善作用。见表1。

2.4对大鼠肾脏Podocin mRNA表达的影响 与单纯肾切组比较，模型组Podocin表达下降(P<0.05)，其余组无显著差异(P>0.05)。与模型组比较，中药低剂量组Podocin表达显著增加 (P<0.01)；中剂量组、厄贝沙坦组Podocin表达均上升(P<0.05)；说明厄贝沙坦、中药中、低剂量组可上调Podocin mRNA表达。见图1，表2。

表1 各组Scr、BUN水平的比较

1.肾切组； 2.模型组； 3.厄贝沙坦组； 4.中药低剂量组； 5中药中剂量组； 6.中药高剂量组

表2 各组大鼠肾脏Podocin mRNA表达

3 讨 论

DN是DM病人死亡的主要原因，大量蛋白尿的发生是DM肾组织损伤的典型标志。目前已经形成共识，即UPro的发生与肾小球滤过屏障异常有密切关系。肾小球滤过屏障包括三层：内皮细胞窗孔、肾小球基底膜(GBM) 以及位于脏层上皮细胞足突之间的裂孔隔膜。而裂孔隔膜是滤过屏障中最主要的部位，可以阻止绝大部分蛋白质漏出到原尿中，故与蛋白尿的发生密切相关〔8〕。近年来已经先后确定了多个由足细胞表达、对维持正常裂孔隔膜功能十分重要的分子成分。其中Podocin是2000年Boute等〔9〕通过定位克隆技术研究发现的新发夹样结构的整合膜蛋白，由NPHS2基因编码，以寡聚体的形式特异性地表达于足细胞SD处。除了作为正常足细胞SD的一种重要的结构蛋白，也有研究发现Podocin集中位于足突之间的紧密连接位点上，可能发挥一种支架的作用将紧密连接蛋白与足细胞的肌动蛋白相连〔10〕。因此观察足细胞Podocin变化对于糖尿病肾病蛋白尿的发生和发展至关重要。

DN属于中医学“消渴病”、“肾消”、“虚劳”、“水肿”、“关格”等范畴， 目前对于DN的病机认识主要是认为本病为本虚标实之证，以脾肾及气血阴阳之虚为本，气滞、湿阻、血瘀、痰聚为标。肾为先天之本，主藏精，司固摄而寓元阴元阳，脾虚日久累及肾元，肾失固摄，则水谷精微下泄，临床表现为蛋白尿及尿糖增高。气为血帅，气行血行，气滞则血瘀、津停，痰瘀互结，瘀阻脉络，久酿成牴积是其关键环节。故拟益气养阴、消牴通络中药复方为治疗DN的基础方，该中药复方经临床及实验研究证明疗效确切〔11，12〕。其中黄芪益气，走而不守，配伍茯苓、砂仁、熟地，气阴兼顾，健脾益气，补肾敛精，利水消肿；水蛭性缓则气血不伤，善入则坚积易破，配伍地龙、鳖甲，活血祛瘀，散结软坚；大黄同煎，可通腑泄热，荡涤积滞，使浊邪从下窍而出；积雪草有清热利湿、消肿解毒之功效。诸药合用，共奏补脾益肾，益气养阴，活血化瘀，利水泄浊之功，使扶正不留邪，祛邪不伤正。另据现代药理研究发现益气养阴、消牴通络中药〔13～16〕能改善肾小球滤过屏障，减轻通透性蛋白尿，抑制血栓形成，降低血小板黏附率，改善DN的血液流变学，延缓DN的发展，保护肾功能。

本实验结果表明中药中、低剂量可显著减少DN大鼠尿蛋白，各剂量均能降低Scr、BUN水平，与厄贝沙坦比较降UPro作用相当，改善肾功能略好，需进一步研究二者的协同效应。本实验提示益气养阴、消牴通络中药可能通过减少Podocin蛋白的丢失，使肾小球滤过膜的完整性得到一定程度的恢复而减轻蛋白尿，但中药短期干预无剂量依赖性，其长期疗效发挥有待进一步研究。

4 参考文献

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