小柴胡汤对C6胶质瘤大鼠微血管密度和肿瘤细胞增殖活性的影响

于慧玲 麻春杰 盖 聪

(北京中医药大学，北京 100029)

C6胶质瘤一般为膨胀性或侵袭性生长，其血管的生成和肿瘤细胞的不断增殖，在C6胶质瘤的发生、发展中具有重要的意义〔1〕。小柴胡汤为中医经典方剂，临床应用广泛，近年来其在肿瘤治疗方面的应用日益引起人们的重视〔2〕，本实验采用免疫组织化学方法检测肿瘤组织的微血管密度(MVD)反映肿瘤的微血管生成情况；同时通过检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达反映肿瘤细胞的增殖活性，旨在探讨小柴胡汤的抑瘤机制，为其进一步推广应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1药物与试剂 小柴胡汤组成：柴胡(78.125 g)、黄芩(46.875 g)、人参(46.875 g)、清半夏半升(42 g)、炙甘草(46.875 g)、生姜(46.875 g)，大枣(30 g)。替莫唑胺由江苏天士力帝益药业有限公司提供；ELISA试剂盒：CD34和PCNA均由南京建成生物有限公司提供；一抗CD34和PCNA购于北京博奥森生物有限公司；SP9710试剂盒和二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购于福州迈新生物有限公司。

1.2实验分组及模型制备〔3〕清洁级Wistar 老年雄性大鼠，体重(321.5±3.3)g，18月龄， 60只右前肢腋窝皮下接种2×106/20 μl的C6胶质瘤细胞悬液；随机分为肿瘤对照组、阳性药A组(替莫唑胺50 mg/kg)、阳性药B组(替莫唑胺25 mg/kg)、小柴胡汤C组(50 g/kg)、小柴胡汤D组(20 g/kg)、小柴胡汤E组(10 g/kg)。

1.3中药制备 小柴胡汤组成中的7味中药，以8倍量蒸馏水浸泡30 min，加热保持微沸30 min，过滤；残渣加6倍量蒸馏水，微沸30 min，过滤，合并2次滤液，混合后滤液干燥浓缩至100 ml，即小柴胡汤E(10 g/ml)；以类似方法浓缩熬制小柴胡汤D(20 g/ml)；小柴胡汤C(50 g/ml)；4℃冰箱保存备用。

1.4给药方法及取材 每组均分别灌胃给予生理盐水、阳性药A、阳性药B、小柴胡汤C、小柴胡汤D和小柴胡汤E，连续服药5 d，休息4 d，共给药3次，于最后1次给药后2 d处死动物，眼球取血，分离血清3 000 r/min，10 min，标记好后置-20℃保存备用；取肿瘤组织(部分-20℃冻存待测，部分固定于10%甲醛液中)。

1.5检测指标

1.5.1大鼠血清及肿瘤组织中CD34和PCNA蛋白含量的检测 采用ELISA酶联免疫法检测；严格按照试剂盒方法操作。

1.5.2大鼠肿瘤组织中CD34和PCNA蛋白水平的检测 采用免疫组织化学方法检测；肿瘤组织脱水、包埋、切片4 μm，60℃烤箱烘烤6 h待测。

1.5.3大鼠肿瘤组织中MVD和增殖指数的检测 MVD的计数是在200倍光学显微镜下，连续计数5个视野的微血管数的平均值；增殖指数的检测：在200 倍光学显微镜下，连续计数5个视野的PCNA阳性细胞数/计数的细胞总数。

2 结 果

2.1各组大鼠血清及肿瘤组织中CD34和PCNA蛋白含量的比较 与肿瘤对照组比较，小柴胡汤各剂量组大鼠血清及肿瘤组织中CD34和PCNA蛋白含量均降低，且随剂量增长降低趋势明显(P<0.01)，阳性药各剂量组大鼠血清及肿瘤组织中CD34和PCNA蛋白含量亦均降低，且随剂量增长降低趋势明显(P<0.01)。见表1。

2.2各组大鼠肿瘤组织中CD34和PCNA蛋白水平阳性强度的比较 与肿瘤对照组比较，小柴胡汤各剂量组大鼠肿瘤组织中CD34和PCNA蛋白阳性表达强度均降低(P<0.01)，C组、D组降低较为显著但二者之间差异无统计学意义(P>0.05)；阳性药各剂量组大鼠肿瘤组织中CD34和PCNA蛋白阳性表达亦均降低，且随剂量增长降低趋势明显(P<0.01)，阳性药A组、小柴胡汤C组和D组之间差异无统计学意义(P>0.05)；CD34和PCNA蛋白阳性表达强度采用Motic Images Advanced 3.2图像分析系统检测灰度值，灰度值越大阳性表达越低，灰度值越小阳性表达越高。见表2。

2.3各组大鼠肿瘤组织中MVD和增殖指数的比较 与肿瘤对照组比较，小柴胡汤和阳性药各剂量组大鼠肿瘤组织中MVD和增殖指数均下降(P<0.01)，阳性药A组、小柴胡汤C组和D组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 小柴胡汤对C6胶质瘤大鼠血清、肿瘤组织中CD34、PCNA蛋白含量的影响

表2 小柴胡汤对C6胶质瘤大鼠肿瘤组织中CD34、PCNA蛋白水平(灰度值)和MVD、增殖指数的影响

2.4肿瘤组织中CD34和PCNA蛋白、MVD和增殖指数的相关性比较 肿瘤组织中CD34和PCNA蛋白呈正相关(r=0.735，P<0.01)，MVD和增殖指数亦呈正相关(r=0.726，P<0.01)。

3 讨 论

大量研究〔4〕表明，肿瘤的生长和扩散与血管的形成密切相关，新生血管不仅为肿瘤组织的生长繁殖提供血供及气体营养，更为肿瘤细胞的浸润、转移提供了可靠的通道。CD34是一种特异度较高的血管内皮细胞标志物，通过抗体与相应的内皮细胞结合，可以直接反映MVD的生成状况，目前许多学者将肿瘤MVD作为肿瘤微血管生成的标志进行研究〔5，6〕。PCNA表达于肿瘤细胞的细胞核，是一种细胞增殖相关蛋白，反映细胞的增殖活性；它是一种仅在增殖细胞中合成与表达的酸性非组胺核蛋白，是DNA复制合成过程中的必需物质，并且在DNA修复过程中发挥重要作用，它的表达仅局限于细胞核内；它在增殖细胞周期中含量的变化与DNA复制时相变化具有一致性，是评价细胞增殖的良好指标〔7，8〕。C6胶质瘤生长迅速且呈恶性侵袭性发展，其中广泛间质微血管形成是胶质瘤生长的生物学基础，肿瘤细胞的增殖活性及肿瘤的微血管形成在肿瘤的生长和转移中发挥重要核心作用，但目前关于胶质瘤血管生成的机制尚不清楚，因此PCNA和CD34的表达状况与肿瘤的侵袭性、发生、发展密切相关。

综上，小柴胡汤可抑制C6胶质瘤细胞的增殖活性及微血管形成，降低肿瘤组织PCNA和CD34的阳性率，但其间的相互关系及机制仍需进一步研究加以论证。本研究结果也为进一步探讨肿瘤细胞的增殖与微血管形成间的相关性及PCNA和CD34的靶向治疗提供一定参考。

4 参考文献

1王金环,李 牧,王守伦.脑胶质瘤局部缓释化疗的研究进展〔J〕.神经疾病与精神卫生,2001;1(4):59-60.

2于绍华.小柴胡汤抗肿瘤作用的研究进展〔J〕.药学服务与研究,2012;12(1):45-8.

3王晓刚,魏学忠,周定标.Wistar 大鼠C6胶质瘤动物模型的肿瘤生长特点〔J〕.军医进修学院学报,2001;22(4):300-2.

4钱金方.增殖细胞核抗原在常见肿瘤的研究进展〔J〕.肿瘤基础与临床,2008;21(4):86-9．

5王艳芬,丁永玲,李家驭,等.Ang-2、CD105 和CD34 在脑胶质瘤中的表达及生物学意义〔J〕.现代肿瘤医学,2008;16(1):23-6.

6章必成,杨 波,刘 健,等.肺腺癌瘤周微淋巴管密度的检测及其预后意义〔J〕. 临床肿瘤学志,2010;15(11):978-82．

7王亚萍,辛晓燕,王 健.增殖细胞核抗原在卵巢上皮性肿瘤中的表达及其意义〔J〕.青海医药杂志,2004;34(4):13-5.

8马文群,李利敏,宋国智.增殖细胞核抗原与肿瘤关系的研究进展〔J〕.河北医药,2011;33(1):600-2.