PKC-α蛋白及mRNA转录水平在妊娠期高血压大鼠肾脏中的表达及意义

杨宏静

(三峡医药高等专科学校，重庆 404120)

妊娠高血压(简称妊高征)，是妊娠期妇女所特有而又常见的疾病，以高血压、蛋白尿、水肿、抽搐、昏迷、心肾衰竭甚至发生母子死亡为临床特点〔1〕。妊高征综合征按严重程度分为轻度、中度和重度，重度妊娠高血压综合征又称先兆子痫和子痫，即在高血压基础上有抽搐〔2〕。妊高征的生理病理改变非常广泛，全身小动脉的痉挛是基本病变，小动脉痉挛可导致多器官系统(如心脏、肾脏、肝脏等)的病理性损害，其中肾功能损伤是妊高征的早期发病特征〔3，4〕。有研究认为，蛋白激酶C(PKC)与妊高征疾病肾脏损害存在着相关关系，本研究通过检测妊高征疾病大鼠肾脏中PKC-α蛋白水平和mRNA转录水平，从而了解PKC-α蛋白及mRNA转录水平在妊高征疾病大鼠肾脏中的表达意义。

1 材料和方法

1.1实验动物与试剂 实验动物：清洁级Wistar大鼠48只(体重200～250 g， 14～16 w)。试剂：亚硝基左旋精氨酸甲酯、生理盐水、乙醚、PKC鼠抗体(美国Santa Cruz公司)、碱性磷酸酶耦联的山羊抗兔IgG(美国Santa Cruz公司)、显色试剂盒、Trizol RNA抽提试剂(美国Promega公司)、RT-PCR一步法试剂盒(美国Promega公司)、TaqDNA聚合酶(上海生工公司)。

1.2动物模型的建立及分组 妊娠鼠模型的建立：将16只Wistar雌性大鼠和32只雄性大鼠以1∶2合笼，第2天早晨取雌鼠阴道分泌物镜检，若发现了精子，则动物模型建立。

分组及处理：将妊娠鼠随机均分为妊娠期高血压疾病组(疾病组)和正常妊娠组，每组妊娠鼠8只；剩余的8只未交配健康孕龄雌鼠为未妊娠组。疾病组妊娠鼠于妊娠第13天(阴道分泌物确认有精子时刻即为妊娠第1天)开始皮下注射亚硝基左旋精氨酸甲酯，注射250 mg/kg；正常妊娠组妊娠鼠则于妊娠第13天注入生理盐水，注射250 mg/kg，1次/d。三组所有雌鼠均在妊娠第21天在乙醚麻醉下打开腹腔，取出肾脏，肾脏样本置于液氮保存待用。

1.3Western印迹杂交〔5〕在取得的肾脏组织中加入5倍体积的缓冲液，在冰浴下用玻璃研磨器(15 000 r/min，30 min)粉碎，后加入细胞裂解液裂解细胞，静置后取其上清液，所得即为胞浆蛋白。将所有的胞浆蛋白样本置于十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶上电泳(5～6 h)，之后进行电转印。然后用1∶200的PKC鼠抗体进行Western印迹，印迹后用1∶2 000二抗性碱性磷酸酶耦联的山羊抗兔IgG抗体处理，利用显色试剂盒对各样本图像进行检测和摄影。

1.4RT-PCR半定量测定〔6〕鼠肾脏组织总RNA采用Trizol一步法进行提取，严格按照逆转录试剂盒的说明进行操作，扩增PKC-α的PCR产物后，检测其mRNA含量。PCR反应各步骤的条件分别为：热启动：94℃，3 min；扩增、变性：94℃，30 s；退火：58℃，1 min；延伸：72℃，2 min，共进行32个循环，最后72℃延伸8 min。PKC-α引物序列：正义：5′-TGA ATC GTG AGT GGA ATG AGT-3′，反义：5′-GGT TGC TTT GTC TCT TCT GAA-3′，扩增片段长度293 bp；β-actin引物序列：正义：5′-GTG GGC CGG TGT AGG CAC CAT-3′，反义：5′-GGT TGG CCT TAG GGT TCA GGA-3′，扩增片段500 bp。PCR产物置于12%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳后，通过UVP凝胶成像分析系统对其表达进行扫描分析电泳条带的灰度值，PKC-α mRNA表达的相对含量=mRNA条带灰度值/β-actin条带灰度值。

1.5统计学方法 采用SPSS17.0软件进行分析，行一般统计描述、t检验、方差分析。

2 结 果

2.1三组肾组织样本的PKC-α表达水平比较 三组肾组织样本均有PKC-α表达，三组间的PKC-α表达水平有统计学差异(P<0.05)；疾病组与未妊娠组肾组织样本的PKC-α表达水平均高于正常妊娠组(均P<0.05)。见图1。

2.2三组的肾组织样本PKC-α的mRNA转录比较 三组的肾组织样本的PKC-α 的mRNA转录水平存在统计学差异(P<0.05)，其中妊高征疾病组与未妊娠组的肾组织样本PKC-α的mRNA转录水平均高于正常妊娠组(P<0.05)。

图1 PKC-α Western印迹结果

图2 PKC-α RT-PCR结果

3 讨 论

PKC属于丝苏氨酸蛋白激酶家族，激活的PKC可使多种蛋白的丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化，从而影响细胞内生物信息的传递，在调节细胞代谢、分化、增殖乃至癌变中具有十分重要的作用；其次，PKC还是Ca2+磷脂依赖性蛋白激酶，广泛存在于组织细胞中，在静息状态下，PKC主要以无活性的形式存在于细胞质中，当受到外界刺激时PKC从细胞质向细胞膜转移，从而发挥其活性作用；PKC可参与一系列与生命现象相关的过程，如：介导细胞增殖与分化、影响细胞周期和细胞凋亡、调节基因表达、参与代谢调节及控制细胞膜功能等；最后，PKC是细胞内诸多信号传导系统、信号传导系统间相互影响的中心环节，而信号传导系统可以通过细胞外刺激来调节细胞的收缩、舒张、增殖分化以及细胞内有关物质的合成等〔7～9〕。

PKC在肾脏中广泛存在，在维持和调节肾脏的功能方面起重要作用。PKC介导妊高征疾病肾脏病变机制为：PKC可改变磷酸化激动蛋白的功能和结构，增大内皮细胞间隙，降低细胞与细胞以及细胞与基质间的连接，从而增加肾脏细胞的通透性，导致尿蛋白〔10〕；PKC在细胞内被激活后，可催化多种蛋白质的磷酸化反应，对血管平滑肌细胞的增生和收缩功能起着重要的调节作用；再次，PKC可降低细胞内的Na-K-ATP酶活性〔11〕；PKC-α为PKC的一个亚型，除具有PKC的以上功能外，国内外研究发现PKC-α可激活有丝分裂原活化的蛋白激酶途径，进而改变肾内血流的动力学状态，提高内皮细胞对白蛋白的通透性和增加转化生长因子(TGF-β)的表达；另外，PKC-α活化后可磷酸化PKC内源性底物，通过胞内一系列的信号转导机制诱导血管通透因子(VPF)的产生，从而引起蛋白尿〔12〕。

综上，妊高征疾病大鼠肾脏中的PKC-α蛋白及mRNA转录水平表达较高，PKC-α蛋白可能是导致妊高征疾病肾脏损伤的因素之一。

4 参考文献

1刘 辉,王伟明,左 群,等.妊娠期高血压发病影响因素病例对照研究〔J〕.中国公共卫生,2012；28(3):270-2.

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6李 怡.可溶性血管内皮生长因子受体1在妊娠高血压综合征中的变化及意义〔D〕.第四军医大学(硕士论文),2005.

7朱野萍.妊娠期高血压疾病的观察及护理〔J〕.辽宁医学院学报,2012；33(2):174.

8Inoue M，Kishimoto A，Takai Y,etal.Studies on a cyclic nucleotide-independent protein kinase and its proenzyme in mammalian tissues.II.Proenzyme and its activation by calcium-dependent protease from rat brain〔J〕.J Biol Chem,1977；252(21):7610-16.

9Jiang P,Kumar A,Parrillo JE,etal.Cloning and characterization of the human heparanase-1 (HPR1) gene promoter：role of GA-binding protein and Sp1 in regulating HPR1 basal promoter activity〔J〕.J Biol Chem,2002；277(11):8989-98.

10王海霞,刘少奎,张殿龙,等.PKCα、βⅡ、η、ζ在肾血管性高血压大鼠中的表达〔J〕.中国医药导报,2010；7(10):27-9.

11柴大军,许昌声,宁若冰,等.RXR激动剂通过抑制PKC激活对抗高糖诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖〔J〕.中国病理生理杂志,2013；29(2):266-71.

12Haneda M，Araki S，Togawa M,etal.Mitogen-activated protein kinase cascade is activated in glomeruli of diabetic rats and glomerular mesangial cells cultured under high glucose conditions〔J〕.Diabetes,1997；46(5):847-53.