烧伤病房老年患者感染铜绿假单胞菌耐碳青霉烯类药物现况

张若文 王 璐 姜焱硕 李 凡

(北华大学医学部，吉林 吉林 132013)

铜绿假单胞菌是医院获得性感染最常见的条件致病菌之一。碳青霉烯类抗菌药物在临床抗铜绿假单胞菌感染治疗中发挥了十分重要的作用，然而，铜绿假单胞菌耐碳青霉烯类抗菌药物临床分离株逐渐增多，并在不同地区、国家播散，对临床控制医院感染造成了严重的危害。铜绿假单胞菌耐药机制复杂，包括抗生素灭活酶或修饰酶的生成、外膜低渗透性、外膜孔蛋白缺失、生物膜形成和主动外排等〔1〕。产金属β-内酰胺酶(MBL)又称金属酶，能水解β-内酰胺类抗菌药物，包括碳青霉烯类系列药物，离子螯合物乙二胺四乙酸(EDTA)、菲咯啉以及巯基化合物抑制酶的活性部分，但不被MBL抑制剂如克拉维酸、舒巴坦等所抑制。产金属酶是铜绿假单胞菌耐碳青霉烯类抗菌药物最主要的耐药机制，已成为目前铜绿假单胞菌耐药机制研究中的热点之一〔2〕。本研究拟探讨烧伤病房铜绿假单胞菌多重耐药性产生和爆发传播的机制。

1 材料和方法

1.1菌株 2006年10～12月，从吉林市某医院烧伤病房8名患者的患部脓汁和血液中分离出8株非发酵菌，所有菌株经常规分离培养后，用Viteck系统鉴定确定为铜绿假单胞菌。

1.2试剂 Taq DNA聚合酶，PCR反应缓冲液，dNTPs，琼脂糖，EDTA，MH培养基。药敏纸片：氨苄西林(AMP)、哌拉西林(PIP)、头孢他啶(CAZ)、头孢噻肟(CTX)、庆大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、亚胺培南 (IMP)、氨曲南(AZT)、复方磺胺(SXT)、氯霉素(CHL)，购自Oxoid公司。

1.3药敏试验

1.3.1Kirby-Bauer法 采用K-B法对常用的15种抗生素进行药物敏感性监测。标准质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853。根据临床实验室标准研究所(CLSI，2006)判读结果〔3〕。

1.3.2MIC值的测定 根据K-B法初选耐药菌株，采用微量肉汤稀释法进行六种药物各15个浓度的体外药物体外抑菌活性(MIC)值的测定。结果判断依据美国临床和实验室标准协会(CLSI)制定的指南。

1.4MBLs菌株的确定 采用双纸片增效法〔4〕。将受试菌均匀涂布于M-H琼脂平板，然后在平板上贴两张IMP(10 μg/片)纸片，其中1张纸片上加入适量EDTA，置35℃孵育16～18 h，比较两张纸片的抑菌圈大小。加EDTA的IMP纸片比不加EDTA的IMP纸片抑菌圈明显扩大，超过了5 mm判断为产酶株。

1.5金属酶基因和第1类整合子检测

1.5.1细菌总DNA提取 根据文献方法提取铜绿假单胞菌临床分离株总DNA〔5〕。

1.5.2引物设计 下载NCBI数据库金属酶基因，采用DNAstar软件设计四对引物，送上海生工合成，见表1。

表1 检测金属酶基因寡核苷酸引物

1.5.3PCR反应 参考文献方法进行〔6〕。

1.5.4PCR产物序列测定 提取PCR产物，用双脱氧链末端终止法进行测序。

2 结 果

2.1K-B法药敏实验 8株铜绿假单胞菌对β-内酰胺类药物，氨苄西林、替卡西林、替卡西林/克拉维酸和头孢唑啉，以及非β-内酰胺类抗菌药物药物，AMK、GEN、妥布霉素、SXT、四环素、CHI等15种抗菌药物耐药率均为100%。

2.2MIC检测 铜绿假单胞菌对头孢噻肟和头孢吡肟(MIC>128 μg/ml)、IMP和AZT(MIC 32～8 μg/ml)表现高度耐药。

2.3MBLs菌株的确定 采用双纸片增效法检测细菌产MBLs情况，结果显示：加EDTA的IPM纸片比不加EDTA的IPM纸片抑菌圈明显扩大，均超过了5 mm(≥20 mm)，说明双纸片增效法试验表型为阳性，证明8株铜绿假单胞菌临床分离株均能产生MBLs。

2.4PCR和测序 以8株铜绿假单胞菌总DNA为模板，采用四种MBLs引物进行PCR扩增，只有VIM引物扩增出目标大小片段，VIM测序结果经DNAstar程序进行拼接和校对后，登陆GenBank数据库进行序列比较分析。比较结果发现与Pseudomonas aeruginosa(GenBank注册号：JN819277.1)核苷酸序列同源性100%，说明铜绿假单胞菌携带VIM-2型MBLs基因。

3 讨 论

碳青霉烯类抗菌药物是一类广谱高效的β-内酰胺类抗菌药物。其抗菌谱广泛，抗菌活性强，对多数MBI(包括超广谱β-内酰胺酶和头孢菌素酶(AmpC 酶)稳定，与第三代头孢菌素没有交叉耐药特性。临床上主要包括帕尼培南、IMP、厄他培南、美罗培南等，是临床上治疗铜绿假单胞菌多重耐药菌株感染的首选的抗菌药物，已成为治疗由革兰阴性菌多药耐药菌株引起严重感染的最后防线。IMP曾经是革兰阴性菌耐药率最低的，是治疗铜绿假单胞菌首选药物,但是随着碳青霉烯类抗菌药物的应用增多，铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药性也有所增加，且耐碳青霉烯类抗菌药物细菌大多数呈多重耐药，甚至广泛耐药〔6〕。

金属酶能水解大多数β-内酰胺抗菌药物，包括青霉素、头霉素、头孢菌素和碳青霉烯类(不包括氨曲南)，其中以IMP和VIM型金属MBL最常见。VIM型金属MBL最早发现于意大利，在意大利维罗纳发现的VIM型金属MBL被命名为VIM-1型〔7〕。截止到2011年底，共发现17型VIM金属β-内酰胺酶(VIM 1～17)。VIM-2型金属MBL于2000年首次在法国首次报道〔8〕。实验设计了IMP、VIM、SPM和GIM基因引物，采用PCR、克隆测序8株均携带VIM-2基因。

本实验结果揭示了碳青霉烯类抗菌药物耐药的铜绿假单胞菌在吉林地区烧伤病房流行，具有导致烧伤病房院内感染爆发流行的危险性。碳青霉烯类抗菌药物耐药的铜绿假单胞菌对头孢菌素类、四环素类等多种抗菌药物表现多重耐药。铜绿假单胞菌携带VIM-2基因决定对碳青霉烯类抗菌药物耐药。临床医疗大量使用碳青霉烯类抗菌药物加速铜绿假单胞菌借助可转移传递因子的扩散，是烧伤病房铜绿假单胞菌爆发流行的主要原因〔9〕。

本实验结果需要引起临床医生和临床微生物工作者的密切关注，应重视对多重耐药铜绿假单胞菌产碳青霉烯酶的菌株同源性监测，防止同一克隆株的播散〔10〕。要预防与控制烧伤病房的铜绿假单胞菌流行，应加强以下工作：对于老年人和高危儿童气管插管时要注意操作手法，要严格掌握各种侵入性诊断、治疗指征，减少对气道黏膜的损伤。要积极采取消毒隔离措施和无菌操作规范，严格遵守器械的消毒、灭菌规程。减少探视人员，保持环境干燥。重视洗手。事实上，预防医院感染最关键、最经济、最有效的环节就是洗手，因此，在诊疗不同烧伤患者之间、进行各项操作前后等方面都要正确的洗手。此外，积极治疗患者基础性疾病，尤其是老年患者，减少烧伤患者住院日。掌握抗菌药物合理使用原则，根据药敏试验结果选用药物。要高度重视控制多重耐药铜绿假单胞菌在医院内播散和院内感染的暴发流行，一旦发现病房有流行趋势要及时报告，以便积极采取控制措施〔11〕。

4 参考文献

1张凤华，王大利，王 晶，等.ICU 铜绿假单胞菌肺部感染的临床分析〔J〕.中华医院感染学杂志，2010；20(6)：875-7.

2肖永红.2008年度ICU细菌耐药性监测〔J〕.中华医院感染学杂志，2010；20(16)：2384-8.

3Clinical and Laboratory Standards Institute，2006.Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 15th information supplement.CLSI document M100-S15.Clinical and Laboratory Standards Institute，Wayne，PA.

4Lee K，Lee WG，Uh Y，etal.VIM-and IMP-type metallo-beta-lactamase-producing Pseudomonas spp.and Acinetobacter spp.in Korean hospitals〔J〕.Emerg Infecti Dise，2003；9(7)：868-71.

5李明成.产志贺毒素大肠埃希菌多重耐药分子机制的研究〔D〕.长春：吉林大学博士论文，2006.

6Santella G，Pollini S，Docquier JD，etal.Carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates：an example of interaction between different mechanisms〔J〕.Rev Panam Salud Publica，2011；30(6):545-8.

7Giakkoupi P，Petrikkos G，Tzouvelekis LS，etal.Spread of integron-associated VIM-type metallo-beta-lactamase genes among imipenem-nonsusceptible Pseudomonas aeruginosa strains in Greek hospitals〔J〕.J Clin Microbiol，2003；41(2)：822-5.

8陈照强，刘一方，朱 宁，等.金属β-内酰胺酶的研究进展〔J〕.国外医药(抗生素分册)，2011；32(3)：11-5.

9Boonkerd N，Pibalpakdi P，Tiloklurs M，etal.Class 1 integron containing metallo beta-lactamase gene blaIMP-1 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa in Thailand〔J〕.J Infect Chemother，2009；15(4):257-61.

10孙 震，殷 俊，高 伟.耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药机制研究〔J〕.中国抗生素杂志，2009；34(1):52-6.

11张凤华，王婷葶，王大利.ICU病房铜绿假单胞菌的耐药性及其产金属β-内酰胺酶的分析〔J〕.中国实验诊断学，2010；14(11)：1762-3.